by İdrar’da Protein varlığının aranması :
İdrarda proteinüri, mikroalbuminüri ve hematüri değerlendirmesi yapılarak böbrek bütünlüğü kontrol edilmiş olmaktadır. Molekül ağırlığı 60 000 D’dan az olan proteinlerin, çap ve büyüklük olarak, glomerül bazal membranındaki por çapından küçük olmaları nedeniyle, teorik olarak glomerüllerden rahatlıkla süzülüp idrara bolca çıkmaları gerekmektedir. Çok az bir kısımları proksimal tübüllerden geri alınsa da, bu proteinlerin büyük miktarlarda idrar ile kaybedilmeleri gerekirdi, teorik olarak. Böyle olmasına rağmen idrara çıkan günlük protein miktarı sadece 150 mg civarındadır. İdrara çıkan bu protein değeri yaklaşık olarak 2- 10 mg/dl civarındadır.
İdrara çıkan bu proteinlerin yaklaşık üçte biri albumin’dir, diğer üçte biri globülin’dir ve geri kalanı yani üçte birinden biraz daha fazlası da Tamm-Horsfall proteinidir. İdrara dökülen desquame hücre kalıntıları, lökositler de idrarda protein pozitifliğine katkı yapmaktadırlar.
Proteinüri nedenleri arasında : Plazma proteinlerine karşı glomerüler geçirgenliğin bozulması ( glomerülonefritler) , tübüler reabsorbsiyonda azalma (orta derecede protein itrahı ; MA:<70000 dalton), prerenal olarak artmış protein oluşumu ( buna overload proteinüri denir : Bence-Jones proteinüri (multiple myeloma),kas travmaları sonucu oluşan myoglobinüri, hemolitik transfüzyon reaksiyonları sonucu oluşan hemoglobinüri, DIC→ fibrin yıkım ürünleri ),tübüler sekresyonun arttığı durumlar (Tamm–Horsfall proteinleri), renal doku ve doku ürünlerinin salınımı, böbrek lenfatiklerinde tıkanıklık sonucu şilüri meydana gelmesi sıralanabilir.
Glomerüler bazal membranda bir hasar var ise idrara albümin kaçışı çok daha büyük miktarlarda olur. Normalde çok az miktardaki albümin glomerüler bazal membranını geçerek idrara çıkar. Albumin’in idrara çıkışı bir günde 30 mg’dan fazla değildir. Aslında albumin çok küçük bir molekül ağırlığına sahip ( 69 000 D.) ve alabildiğine yoğun eksi elektrik yüküne sahip bir önemli moleküldür. Bu molekül çapı ile glomerul bazal membranındaki por’lardan rahatça geçip idrara bol miktarda çıkması beklenirken, Yüce Allah ( C.C.)’ın kurduğu şaşmaz düzen nedeniyle idrara çok sınırlı ölçüde çıkabilir ve bu da bizi rahatsız etmez. Bunun nedeni glomerul bazal membranında bulunan heparansülfat gibi, siyalik asit gibi kuvvetli eksi yüklü moleküllerin bu membranın yapı taşını oluşturmaları ve eksi yüklü albumini kana doğru geri elektriksel yükten dolayı itmeleridir.
Şekil 1 : Glomerul bazal membranının hasarlı durumda değişen elektrik yükü ve sonucu.
Eğer glomerüllerde bir hasar meydana gelirse, özellikle glomerulonefritlerde bazal membrana karşı oluşan antikorlar,bazal membrandaki eksi ağırlıklı yük dengesini artı yük lehine döndürürler. Yapı elektriksel yük olarak bozulur, ayrıca mekanik olarak da tahrip olan ve genişleyen porlar nedeniyle membran bariyeri iyice yıkılır. Bu durumda idrarda bol miktarda protein kaçışı yani albuminüri meydana gelir. Bir noktayı da gözden çıkarmamalıyız : Hasarlı glomerul membranından Bowman kapsülüne kaçan proteinlerin bir kısmı tübüler reabsorbsiyon nedeniyle kan dolaşımına geri emilirler. Genellikle bu durumda idrarla kaybolan protein miktarı 3 – 4 g’a ulaşabilir. Burada idrara kaçan protein daha ziyade albumin’dir.
Glomerul bazal membranı normal fakat tübüller hasarlı ise : Yani izole bir tübüler hasar var ise, zaten glomeruler bazal membran sağlam olduğundan çok az protein yani albumin kaçışı olacaktır, bunun da bir kısmının tübüler reabsorbsiyon yoluyla geri emilmesi gerekirken, tübüler hasar nedeniyle geri emilim daha da artar. Bu nedenle tübüler hasarlarda proteinüri, glomeruler hasar olanlara göre çok daha azdır. Çünkü tübüler hasar nedeniyle reabsorbe edilen protein miktarı, kontrolsüz şekilde artar. Böylece tübüler hasarda idrara çıkan protein miktarı patolojik düzeyde olmasına rağmen, glomerüler hasar durumunda görülenden daha azdır. Tübüler hasarda günlük protein kaybı 2 g’ın altındadır. Burada idrara çıkan proteinler daha ziyade alfa 1 mikroglobülin, beta 2 mikroglobulin gibi düşük molekül ağırlıklı proteinlerdir. Bu durum tübüler hasarın en önemli bulgusudur. Bu şekilde tübüler hasar yapan durumlar : Fanconi sendromu, sistinozis, Willson hastalığı, piyelonefrit ve renal transplantasyon sonrasında doku rejeksiyon olayının meydana gelmesi gibi durumlardır. İdrar analizleri için kullanılan dipstick idrar stripleri sadece albumine hassas olduğundan, tübüler hasarda idrara çıkan albumin dışı proteinleri belirleyemezler. Çünkü izole tübüler hasarda albuminüri olmaz, dolayısıyla da idrar strip çalışmasında yalancı negatif proteinüri görülür. Bu yalancı negatif proteinüri’yi atlamamak için, %3’lük sülfo salisilik asit çözeltisi ile ayrıca protein presipitasyonu aranmalıdır.
Şekil 2 : Tübüler hasar tesbiti.
Bazen de dolaşımda bulunan protein miktarları aşırı oranda arttığında hemoglobin, miyoglobin ve immünoglobülinler idrara çıkabilirler. Böyle bir durum gerçekleşirse, direkt olarak nefrotoksik etki meydana gelir. Bu vakalarda görülen proteinüri’ye owerflow proteinüri denir.Özellikle miyoglobin’in aşırı idrar atılımında akut tübüler nekroz oluşabileceği unutulmamalıdır.Hemoglobin ise böbrekler için daha az toksiktir. Hemoglobin idrara çıkınca eğer hipovolemi de var ise nefrotoksik etki ortaya çıkar. Bu proteinlerin dışında çok değişik bir protein’in idrara çıkışı olan bir hastalık vardır ve adı Multiple Myelom’dur.
Bence Jones Proteinürisi :
Multiple Myelom’da ( MM ) idrarda çıkan özel protein’in ismine Bence Jones protein denir. Bence Jones Proteini tübüler hücreleri harab eder. Tübüler hücreler harab olduğu için daha çok protein kontrolsüzce reabsorbe edilir. Fakat bu kontrolsüzce, hasarlı tübüler hücrelerden reabsorbe edilen diğer proteinler Bence Jones proteininden daha küçüktürler. Bu hasarlı böbreğe de Myeloma Böbreği denir. Bir paraprotein olan Bence Jones proteinini neoplastik plazma hücreleri üretirler. Bence Jones paraproteini’nin idrarda tesbiti en iyi şekilde protein elektroforez yöntemi ile yapılır. Fakat önemli bir husus vardır, bu paraproteinin idrar konsantrasyonu oldukça düşük olduğundan, eğer elektroforez yöntemiyle tesbiti yapılmak istenirse, idrar en azından 200 kez konsantre edilmelidir. Elektroforez’de Bence Jones protein’in yürüdüğü bant’ta kendisini görüntülemek için kullanılan boya Amido Black veya bazen de Coomassie Brillant Blue boyalarıdır.
Şekil 3 : Multiple Myelom Kliniği ve laboboratuvar bulguları.
Bence Jones proteini immünglobülinlerin hafif ( light ) zincirlerinden oluşan patolojik bir proteindir. Hafif zincirler LAMBDA ve KAPPA’dır. Ancak patolojik idrarlarda bulunur. En çok kappa tipi hafif zincir tesbit edilir. Bu patolojik idrar Multiple Myelom’lu hastaların en az % 60’ının idrarında tesbit edilir.
Bu patolojik idrar Multiple Myelom hastaları dışında, WALDENSTRÖM MAKROGLOBULİNEMİ , KRONİK LENFOSİTİK LÖSEMİ ve AMİLOİDOZ gibi hastalarda da tesbit edilir.Multiple Myelom İngilizce kelime başlıkları ile CRAB şeklinde özetlenebilecek bir hastalıktır. CRAB : C, kalsiyum durumunu belli eder, kemiklerin tahrip olması ile ortaya çıkan veya hafif zincirlerden ortaya çıkan hiperkalsemi’yi tanımlar ; R, Böbrek ( renal ) yetmezliğini belirtmektedir, daha ziyade E.Coli bakterisine ait piyelonefritler görülmektedir ; A harfi anemiyi belirtmek için kullanılır, artan interleukin 6 kemik iliğini baskıladığı için normokrom normositer anemi meydana gelir ; B harfi ise Bone ‘dan yani kemik’den gelmektedir. Özellikle kafatası kemiğindeki zımba dliği gibi kemik yenikliklerini, harabiyetlerini anlatmakta B harfi kullanılır.
Şekil 4: Bence jones proteini’nin ( sadece mavi çizgiler ) invitro presipitasyonu ve çözülmesi.
Bence Jones proteini 40 ile 60 santigrad derece arasındaki sıcakliklarda presipite olur, sıcaklık artırılıp 100 santigrad dereceye çıkarılırsa, presipite olan Bence Jones proteini çözülür.
Yaklaşık olarak 30 mg kadar proteinin günlük idrara çıkması normaldir. İdrar’da protein değerinin pozitif çıkması klinisyen hekimlerin kafasını en çok karıştıran durumların başında gelir.Bu nedenle bu konu daha net olarak ortaya konulmalıdır. Bu konuda onlarca ölçüm metodu vardır. Bunların bazıları tarihsel öneme sahiptir, bazıları ölçüm tekniğindeki teknolojik gelişmenin son halkasını göstrermektedir, bazıları ise ekonomik katkısı nedeniyle rutin kullanımda kabul görmüş olanlardır. Bu konuda en eski metodlardan birisi de %3’lük sülfosalisilik asit kullanan nonspesifik türbidimetrik metod’dur.
Şekil 5: Sulfosalisilik asit deneyi.
Sülfasalisilik asit bulanıklık metodunda eğer hiç bulanıklık olmaz ise idrar proteini 5 mg/dl’den daha düşüktür. Eğer bulanıklık belli belirsiz, silik bulanıklık şeklindeyse trace yani eser miktarda idrara protein kaçmıştır denir. Eser yani trace miktarda idrara protein çıkışı demek yaklaşık 20 mg/dl protein ölçülmesi demektir. Eğer idrarda proteinüri çıkışını 1 ( + ) pozitif bulursak, idrarda belirgin bir bulanıklık vardır. Bunun rakamsal değeri 50 mg/dl protein’dir. Eğer idrar’da 1000 mg/dl protein çıkışından bahsediyorsak o takdirde bunun gösterilişi 4 ( + ) olarak rapora yansımaktadır.
İdrar testlerinde ortaya çıkan bulanıklığın nedeni bir çok etken ile eşleştirilebilir. Eğer bir deney tüpündeki idrar numunesi, bir alev üstüne tutulup ısıtıldığında bir müddet sonra bir bulanıklık oluşabilir. Bu bulanıklığın nedeni ya idrarda bulunabilen fosfatlardır, ya karbonatlardır ya da proteinlerdir. Eğer bu bulanıklık oluşunca üzerine %3’lük asetik asit damlatılırsa, bulanıklık derecesi değişmez hatta bazen artarsa bu bulanıklığın nedeni idrarda bulunan proteinlerdir. Tam tersine oluşan bulanıklığın üzerine asetik asit damlatıldığında bulanıklık azalır veya kaybolursa, bulanıklık nedeni idrarda bulunan fosfat ve karbonatlardır.
Şekil 6 : İdrar’da ısıtma ve asetik asit deneyi.
Günümüzde kullanılan idrar striplerinde protein ölçümü, stripe emdirilen bir indikatör yardımıyla olmaktadır. Bu indikatör ( Tetra Brom fenol Mavisi, TetraKloroFenol-TetraBromoSulfoFtalein ), asit pH ortamında SARI renk verir, ortamda protein var ise veya alkaline tedavilerde, bakteriyel kontaminasyonlarda ( üreyi parçalar amonyak alkali ortam yapar ), test stripinin aşırı nemlenmesi durumlarında ; oluşan iyonlar nedeniyle ( amonyum = alkali ) ortam alkaliye kaydığından stripin rengi yeşilimsi- mavi renk halini alır. Buradan da anlaşılacağı üzere alkali pH’daki idrarlarda yalancı pozitif olarak proteinüri saptanmaktadır. Bu duruma alkali idrarlarda çok dikkat edilmelidir. Özetle, strip tayinlerinde alkali idrarlardaki proteinüri’ye sorgulayıcı bakmak gerekir.
Eğer idrardaki proteinüri’nin nedeni albümin ise bu durum strşp testlerde ziyadesiyle ortaya çıkacaktır. Eğer idrardaki proteinüri’nin nedeni albümin değil de globülin kaynaklı ise o takdirde bu durum strip test’de çıkmayacaktır. Çünkü strip testler albumin’e duyarlıdırlar. Globülinlere duyarsızdırlar, tesbit edilemezler. Bu amaç için globülinleri ortaya çıkarabilmek, gösterebilmek için manuel olarak asitte çöktürme deneyi kullanılmalıdır. Eğer idrarda proteinüri globülinlerden kaynaklanıyor ise strip test negatif olsa bile, asitte çöktürme deneyi pozitif bulunur.
Şekil 7 : Örnek Patolojik İdrarın Biyokimyasal strip testi ve proteinüri görünümü.
Test stripleri organik iyotla, X-Ray kontrast maddeleri ile, tolbutamide ( sulfanilüre – potasyum kanal blokörü ) ile yalancı pozitif reaksiyon vermedikleri için, diğer idrarda protein arama metodlarına göre bu yönden daha avantajlı görünürler. Radyografik maddenin idrar’a etkisi yaklaşık 3 gün sürmektedir. Bu tip durumlarda ideal analiz zamanı en az 3 gün sonra olmalıdır.
Kalitatif idrar analizlerinde kalitatif protein tesbiti sorusunun cevabı var veya yok şeklindedir. Bu nedenle bu amaç için kullanılan yöntemler daha ziyade ısıtma, asit muamelesi ile çöktürme yani presipitasyon yöntemlerini içermektedirler. Aslında presipite edici yöntemlerde kullanılan asitlerden sulfosalisilik asit veya trikloroasetik asit ile oluşan bulanıklık bir spektrofotometre ile veya daha iyisi bir nefelometre ölçülürse, bu ölçüm esnasında standart çözeltiler ve konsantrasyonlar da kullanılırsa, bu durumda kantitatif bir ölçüm yapılmış olur. Doğru ölçüm sonucu elde edebilmek için hassasiyet çok önemlidir. Trikloroasetik asit ilave edilerek presipite edilen idrara, saoyum hidroksit ilave edilirse çözülür ve biüret metodu ile de peptit bağları ile kompleks yapan bakır üzerinden protein miktarı ölçülür. Biüret molekülü bakır ile kompleks oluşturur ve mavi-mor renk meydana gelir. Peptit bağları da yapı olarak biüret molekülüne benzediği için ve aynı şekilde bakır iyonları ile kompleks yapıp mor renk oluşturduğu için, bu reaksiyona genel olarak Biüret reaksiyonu, kullanılan reaktife de biüret reaktifi denir. Biüret reaktifinin içeriğinde bakır ( bakır sülfat ), sodyum hidroksit ( alkali ortam sağlar ) ve potasyum sodyum tartarat ( bakırı stabilize eder ) vardır. Biüret metodu sonucunda mor renkli kompleks oluşması durumunda bu renk 540-560 nm dalga boyunda spektrofotometrik ölçümde saptanır. Rengin koyuluğu ile protein konsantrasyonu doğru orantılıdır. Biüret metodu 5 ile 160 mg/ml arasınadaki konsantrasyonları başarı ile ölçebilir.
Şekil 8 : Biüret yöntemi ile peptit bağı tesbiti.
Biüret metodu zaman içersinde Bicinchoninic Asit ( BCA ) ve Lowry metoduna modifiye olarak daha hassas ölçümlere yaklaşmışlardır ( 0.0005 – 2 mg/ml ). Biüret metodu dışında bazı dye-binding ( boya bağlanması yoluyla tesbit ) metodları da vardır. Bu metodlarda proteinlere bağlanan boyalar kullanılır. Bu boyalar Amido Black, Coomassie Brillant Blue, Ponceau S, Nigrosin gibi boyalardır. Bunlarla okumalar kolorimetrik olarak yapılabilir.
Esbach reagentleri ile de protein tesbitleri önemlidir. Burada kullanılan ayıraçlar pikrik asit ve sitrik asit’dir. Bu analiz için özel derecelendirilmiş Esbach tüpü gereklidir. Esbach tüpünde U yazan çizgiye kadar idrar konulur, peşinden R yazan çizgiye kadar da reaktifler konulur. Tüp alt üst edilerek idrar ve reaktifler homogen olarak karıştırılır. Daha sonra 24 saat boyunca oda sısında inkübasyona bırakılır. Süenin bitiminde meyadana gelen çökeltinin yüksekliği dereceli tüpte ölçülerek idrardaki protein miktarı g/L cinsinden bulunur. Esbach ile ölçüm aralığı 0.5 g/L ile 12 g/L protein seviyesidir. Bu limitlerin dışında Esbach yöntemi kullanılmaz.
Şekil 9 : Esbach tüpü, Esbach reaktifi, Esbach ölçümü.
Birçok protein yapısında TİROZİN ve TRİPTOFAN aminoasitleri vardır. Bu yapıdaki proteinler bu aminoasitlerden dolayı FOSFOTUNGUSTİK asit ve FOSFOMOLİBDİK asit ile mavi renk verirler. Bu iki reaktife Folin Ciocalteau reaktifi denir. Bu reaktif Lowry metodu ile protein tayininde kullanılır. Lowry metodu protein tayininde Biüret metodunun peşi sıra kullanılır. Lowry metodu, Biüret metoduna yardımcıdır. Lowry metodu 10 mikrogram düzeyinde proteini bile tesbit edebilir. Tek başına kullanılan Biüret metoduna kıyasla Lowry metodu, yaklaşık 100 kat daha hassas ve doğru ölçüm yapabilir. Lowry metodu aslında iki grup reaktifi de kullanır. Bunlar Biüret reaktifi ve Folin & Ciocalteau reaktifleridir.
Şekil 10 : Lowry metodu ve kullandığı ayıraçlar.
Mikroalbuminüri :
Mikroalbuminüri nicelik olarak çok küçük miktarlarda proteinin ( albumin, beta 2 mikroglobulin ) idrara çıkmasıdır. Bu miktar, normalde idrara çıkması gereken protein düzeyinden fazla olduğu için, mikroproteinüri denilir. Mikroproteinüri patolojik bir durumu gösterir. Fakat buna rağmen kovansiyonel ölçüm metodlarıyla ölçülemeyecek kadar da düşük miktardadır. Yaklaşık olarak idrarda 20 – 200 mg/L civarında bulunan proteinler, mikroalbuminüri sınıfına dahil olurlar. Zaten idrar strip protein ölçümleri de 200 – 300 mg/L’den daha yüksek değerleri tesbit eder. İdrar strip’leri mikroalbuminüri’yi tesbit edemez.
Şekil 11 : Mikroalbuminüri ile kalp damar hastalıkları arasındaki ilişki.
Mikroalbuminüri nelerin göstergesi olabilir ?
Mikroalbuminüri erken glomeruler hasar habercisidir. Eğer bir hasta Tip 2 Diyabet mellitus tanısı almışsa ve bu hastanın idrar analizinde mikroalbüminüri saptanırsa, bu durumda hasta için ‘’ normal duruma göre 5-6 kat daha fazla kalp damar hastalıklarına maruz kalabilecek bir hastadır ‘’ öngörüsünde bulunulabilir.
Mikroalbuminüri başlıca : Anormal vasküler fonksiyon göstergesi olduğu gibi vasküler permeabilite artışının da habercisidir. Mikroalbuminüri kardiovasküler riski arttıran bağımsız bir risk faktörüdür ve diffüz endotel hasarını haber verir. Mikroalbuminüri ayrıca vasküler hastalık patogenezinde kritik önem taşıyan bir prekürsör görevi görür ve proliferatif diyabetik retinopatinin de gelişeceğini haber verir. Ayrıca böbrek disfonksiyonunun en erken belirteçlerinden biridir ve glomerüler filtrasyonda fonksiyon bozukluğunun göstergesidir.
