by İdrar’da bulunan Glukoz ve diğer şekerlerin tesbiti :
İdrarda glukoz’un ölçülebilir düzeyde bulunması, üç önemli fizyolojik olayın kendi aralarındaki dengenin bozulmasına bağlıdır. Bu 3 önemli olay : Glomerüler kan akışı, tübüler reabsorbsiyon hızı ve idrar akımı arasında mevcut olan dengenin bozulmasıyla glukozüri meydana gelir. Eğer bir idrara glukoz çıkmış ve biz bunu ölçtüysek hastanın kan şekeri 180 mg/dl, yaşlılarda ise 160 mg/dl üzerindedir. Çünkü bu değerler eşik değerlerdir.
İdrar’da glukoz ölçümleri çok değerlidir, fakat bazen yanıltıcı sonuçlar da verebilmektedir. Bu yanılgıyı ortadan kaldırmak için hastaları 24 saat boyunca toplanan idrarında glukoz ölçmek daha faydalı olabilir.
Glukozüri, diyabet mellitus hastalığı dışında birçok hastalığa eşlik edip beraberinde bulunabilir. Bu hastalıklar: Hipofiz ve adrenal bozukluklar, Cushing sendromu, akromegali, hiperadrenokortikosizm, pankreatik tümörler, pankreatitler, hipertiroidizm, feokromasitoma, kistik fibrozis, santral sinir sistemi bozuklukları, beyin tümörleri, beyin kanamaları, asfiksi, hipotalamik bozukluklar, yanıklar, bazı ciddi enfeksiyonlar, kırıklar, miyokardiyal enfarktüsler, üremi durumları, karaciğer bozuklukları, glikojen depo hastalıkları, obesite, uzun süren açlık sonrası aşırı beslenme, tiyazid diüretik kullanımı, oral kontraseptif kullanımı, kortikosteroidlerin kullanımı, adrenokortikotrofik hormon ( ACTH ), gebelik gibi durumlardır.
Gebelik’de volüm arttığından, kan dolaşımı çok arttığından, GFR ( glomeruler filtrasyon hızı ) çok artar. GFR’nin gebelerde bu kadar aşırı artışı, kan glukoz moleküllerini bu artmış basınç ile birlikte idrara sürükler. Bunun için önce glomerüllerden süzülür, tübüle geçer. Tübülde normalde tübüler reabsorbsiyon ile geri emilmesi gerekir fakat gebelik’de GFR o kadar hızlıdır ki, tübüler reabsorbsiyon bu GFR hızına yetişemez, yetersiz kalır ve böylece idrara glukoz çıkar. Oysa bu gebe’de kan glukoz düzeyi normal hatta düşük bile olabilir.
Şekil 1 : Gebelik’de glukozüri nedeni.
Aslında bu olay, dolaylı da olsa tübüler rebsorbsiyon disfonksiyonudur. Çünkü normal olan tübüler reabsorbsiyon, GFR’nin çok aşırı artmasından dolayı yetersiz gibi davranmıştır ( disfonksiyon ).
Bir hastada glukozüri doğru olarak saptanmış ve pozitif bulunmuşsa, buna karşın kan glukoz düzeyi için de doğru ölçüm yapılmış ve normal düzeyde bulunmuşsa, bunun en önemli sebebi renal tübüler disfonksiyon’dur. Renal tübüler disfonksiyon yapan durumların en başında : Galaktozemi, sistinozis, kurşun zehirlenmesi, multiple miyeloma ve fankoni sendromu gelmektedir.
İdrar’da monosakkarit de di sakkarit de az miktarda tesbit edilebilir. Disakkaritler için idrarda çıkış 24 saatte 50 mg’a kadar normaldir. Eğer bu çıkış 50 mg düzeyini geçerse o takdirde barsak hastalıklarını, Sprue’yu, akut enteritleri, gözden kaçırmamalıyız. Böyle durumlarda 24 saatte idrara çıkan disakkarit miktarı 200 mg’ı bile geçebilir. Bundan başka kalıtsal metabolik hastalıklarda da fruktozüri, laktozüri, galaktozüri, maltozüri, ksilozüri görülmektedir.
Şekil 2 : Monosakkarit ve disakkarit anomerik karbonları.
İdrar striplerinde glukoz tesbiti için kullanılan glukoz oksidaz metodu adından da anlaşılacağı gibi sadece glukoza spesifiktir. Diğer şekerlerin tesbiti için kullanılmaz. Bu nedenle diğer şekerleri de ( laktoz, fruktoz, galaktoz, maltoz, pentoz ) ölçebilmek klinik için anlamlı olacak ise, özellikle çocuk hastalarda ayıraç olarak BAKIR kullanılmalıdır. Hatta iki testi de ardışık olarak kullanmak ayırıcı tanıda da yol göstermektedir. Örneğin bir çocuk hastada glukoz oksidaz testi sonucu idrarda glukoz negatif olarak bulunmuş ise fakat, BAKIR testi ile sonuç pozitif ise, bunun anlamı: glukoz dışındaki indirgeyici şekerler idrarda bulunmaktadır.
Normalde yeni doğan bir bebek hayatının ilk 2 haftası idrara glukoz, laktoz, fruktoz ve galaktoz çıkartır. Bu durum bakır testi ile saptanabilir. Aynı şekilde hamile kadınlar ve lohusalar da, idrara laktoz çıkışı pozitif olan gruptadırlar.
Benedict testi çok hassas bir testdir. Askorbik asit ve homogentisik asit, bakırlı testleri bozmaz.
Fruktoz ise hidroklorik asit’de çözülen resorcinol ile reaksiyon ( Seliwanoff ) vermektedir.Sıcak hidroklorik asit ile muamele edilen Fruktoz, hidroksi metil furfural oluşturur, ortama rezorsinol ilave edilirse, furfural’e bağlanır ve kırmızı renkli yeni bir molekül oluşur.
Pentozlar ise asitlerle ısıtılırlarsa aynı şekilde furfural oluştururlar. Ortama orsinol ilave edilirse bağlanma oluşur ve mavi-yeşil renkli bir molekül meydana çıkar. Orsinol, fruktoz ile kırmızı renk verir, çoğu karbohidratta ise kahve rengi renk verir.
Şekil 3 : Fehling deneyi.
İDRARDA reagent striplerin glukoz tesbit metodunda ard ardına iki enzim kullanılır. Bunlar glukoz oksidaz ve peroksidaz enzimleridir. Bu metod sadece glukoz için spesifiktir.Yani diğer şekerler örneğin fruktoz ve laktoz ile reaksiyon vermezler. Bu metod glukozun indirgeyici gücünü kullanarak çalışan bir sistemdir. Dolayısıyla glukoz gibi güçlü bir okside edici olan temizleyici deterjan artıkları, bu testi yalancı pozitif hale getirebilirler. Eğer bir idrar testinde idrar dansitesi düşük ise, bu idrar testlerinde yalancı glukozüri saptanmasına neden olabilir.
Şekil 4 : Strip test’deki glukozüri tesbit reaksiyonları ve idrar strip muhtevasına emdirilen reaktifleri gösteren şekil.
Glukozürisi olan bildiğimiz bir Diyabet mellitus tip 2 hastasının idrar dansitesi yüksek ise, bolca portakal ve greyfurt suyu içtiğinden dolayı idrarda vitamin C atılımı da yüksek ise, yalancı negatif glukozüri tesbit edilir. Ayrıca ortamda vitamin C ve homogentisik asidin bulunması enzimatik reaksiyonları inhibe eder. Eğer idrarda glukozüri tesbiti önem arzediyorsa idrarda glukoz aranması işlemine derhal başlanmalıdır, yada kısa süreli bekletilmeler için idrar buzdolabında muhafaza edilmelidir, aksi takdirde eğer idrar uzun süre bekletilmek zorunda kalınacaksa koruyucu olarak sodyum fluorid kullanılabilir. O takdirde kullanılan sodyum fluorid, mevcut olan glukozüri’yi maskeleyebilir, var olan glukozüri’yi yalancı negatif duruma getirebilir.
Yukarıdaki şekilde dikkat edilirse, iyi bir indirgeyici olan glukoz, önce moleküler oksijendeki sıfır ( 0 ) değerli O2’yi H2O2’deki oksijenin -1 değerine indirger. Daha sonra ilave edilen iyi bir indirgeyici ajan olan renksiz kromojen madde ile ardışık olarak -1’e indirgenmiş oksijen, sudaki ( H2O ) -2 değerindeki oksijene kadar indirgenmektedir. Böylece glukoz, oksijeni sıfır değerden -2 değere kadar indirger. Yukarıdaki reaksiyonun anlatmak istediği budur. Bu arada bu redoks reaksiyonlarında biri indirgenirken, diğeri yükseltgenmektedir. Glukoz oksidazın katalize ettiği birinci reaksiyonda glukoz yükseltgenirken moleküler oksijen indirgenmekte, peroksidazın katalize ettiği ikinci reaksiyonda ise kromojen madde yükseltgenirken, hidrojen peroksitteki oksijen, sudaki oksijen haline gelerek indirgenmektedir.
Şekil 5 : Kromojen maddeler.
Yükseltgenen kromojen madde’ye 3 örnek verebiliriz. Bunlar Ortho-toluidin, potasyum iyodid ve Aminopropil karbazol’dur. Ortho Toludidin kromojen madde olmasına rağmen, glukoz tayin metodounda reaktif olarak da kullanılır. Fakat bu metod tüm aldohekzozlara ( mannoz, galaktoz, ksiloz ) uygulanabilir, glukoza spesifik değildir. Ortho toluidinin stabilizasyonu için thioüre ilave edilir. Hemoliz ve ikterik numuneler sonucu interfere ederler. Ortho toluidin glasiyal esetik asitte çözülerek ve içine de koruyucu olarak thioüre ilave edilerek bir reaktif oluşturulur, kahverengi bir şişe içinde saklanır. Bir gece dinlendirildikten sonra kullanılır.
Glukoz’un ve diğer monosakkaritlerin yükseltgenip karşısındaki molekülü indirgeyici özelliklerinden testlerde çok yararlanılan bir durumdur. Glukoz tesbiti için bu testlere Benedict, Fehling, Nylander gibi değişik isimler de verilir. Benedict ve Fehling ( Alman bilim adamı Hermann von Fehling buldu – 1850 ) çözeltileri BAKIR elementini kullanırlar. Benedict çözeltisi tek bir çözelti olduğu için, bu anlamda A ve B olmak üzere iki farklı çözeltiden oluşan Fehling çözeltisine kıyasla daha pratik bir çözeltidir. Karbohidratların serbest aldehid ve keton gruplarını alkali ortamda tanıyan çözeltilerdir. Isı yardımı da gereklidir. İndirgenen bakır elementidir. Pikrik asit de glukoz karşısında iyi bir inidirgenendir. Bu nedenle pikrik asit ile reaksiyon veren kreatinin de yalancı pozitif reaksiyon verir.Tüm bu testler toplu olarak ve özet şekilde aşağıdaki şekilde gösterilmiştir.
Şekil 6 : Benedict, Fehling, Nylander, Pikrat testleri.
Alkali ortam ve ısıtma gerektiren İndirgeyici metodlar, bir çok indirgeyici molekül tarafından interfere edildiği için, glukoza spesifik değildir ve çok güvenli metodlar değildirler. Özellikle ürik asit, kreatinin, glutatyon interfere edici indirgeyici maddelerdir. Serumda bu metod kullanılırsa adına Somogyi-Nelson metodu denilir, glukozun +2’den +1’e indirgediği bakır, arsenomolibdik asidi molibden mavisine çevirir.
Maliyeti çok yüksek olan ve idrar strip testlerinde kullanılmayan Hekzokinaz – G6PD sisteminden de bilgi anlamında birkaç cümle ile bahsetmek gerekmektedir. Bilindiği gibi hekzokinaz enzimi sadece glukoz’a özgü değil tüm hekzozlara özgüdür dolayısıyla spesifik değildir. Fakat Glukoz’a etkidi mi glukoz 6 fosfat oluşturur ve glukoz 6 fosfat sadece glukoz tarafından oluşturulur. Böylece bu iki enzim ardı ardına kullanılarak, çok özgül bir reaksiyon elde edilir. Sonuçta 6-fosfo glukonolakton oluşur, reaksiyona giren okside NAD, NADH2 olarak indirgenir bu absorbans artışı 340 nm’de spektrofotometrede okunabilir. Fakat bu metod idrar için mutad olarak kullanılan bir metod değildir.
Şekil 7 : Hekzokinaz – G6PD testi.
İdrar’da şekerlerin tesbitinden başka şeker türünün de tesbiti ( glukoz, fruktoz ) önemli olabilir. Çünkü tüm şekerler indirgendir. Diğer şekerler glukoz’un verdiği reaksiyonu interfere ederler. Aslında bu amaçla kulanılan en iyi metod glukoz oksidaz metodudur. Çünkü sadece glukoza spesifiktir. Bunun dışında glukoz ve diğer şekerleri idrarda tanımlamak için ileri metod olarak kromatografi’den yararlanılabileceği gibi, polarimetrik ölçümler de olabilmekte, kimyasal metodlarla, ozazon deneyleriyle, hatta fermentasyon deneyleriyle de bu ayırımı yapılabilmektedir.
Polarimetre, monosakkarit çözeltilerin polarize ışığı farklı açılarla saptırması ile monosakkarit çözeltilerini birbirinden ayırabilir. Polarimetreler optikçe aktifliği belirlerler. Sadece Şeker solüsyonları için kullanılan polarimetrelere sakkarimetre denir. Sakkarimetre polarimetre’den bira daha değişiklik yapılarak elde edilmiştir ve genellikle sakaroz yüzdesi tayin eder. Aşağıdaki şekilde polarimetre prensibi gösterilmiştir. Uzun tüp olan kısma monosakkarit çözeltisi veya içinde şeker tipi aranacak idrar içeriği dökülür.Tek bir düzlem içersinde titreşebilen polarize ışık, bu çözeltiden geçerken düzlem değiştirebilir. Sağa veya sola, aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi ışık düzlem değiştirir. Bu düzlem değiştirmesi belli bir açıyla olur. Glukoz polarize ışığı sağa, fruktoz ise polarize ışığı sola doğru çevirir.
Aşağıdaki şekilde görüldüğü gibi doğal ışık kaynağından veya vir sodyuım lambasından monokromatik ışık çıkar, bir polarizatör ( polarizör ) yardımıyla polarize olmayan ışık, polarize hale getirilir. Ortadaki tüp kısmına idrar dökülür, analizör kısmında açısı ölçülür. En çok kullanılan polarimetre Laurent Polarimetresidir.
Şekil 8 : Polarimetre ve ölçüm prensibi.
Ozazon deneylerinde glukoz, galaktoz ve laktoz ayrımı yapılabilir. Bu amaç için kullanılan ayıraç fenil hidrazin’dir. Asit ortamda sodyum asetat ilavesindeki fenil hidrazin ayıracı, ısıtılırsa ortamda bulunan glukoz, galaktoz veya bunların birlikteliği olan laktozla önce fenil hidrazonları daha sonra da ozazon’larıverir. Ozazonlar yani oluşan kristaller mikroskopta incelendiğinde deniz kestanesi görünüm şeklinde olana ozazonların laktoz’dan oluştuğunu, iğsi şekilde oluşan ozazonların ise glukozdan ileri geldiğini söyleyebiliriz. Bu durumun tesbiti aşağıdaki şekilde gösterilmiştir.
Şekil 9 : Ozazon oluşumu.
