Fotoğraf 1 : Sir Dr. Hans Adolf Krebs.

Enerji bilançosu hesaplandığında : Aerobik glikolizde son laktat’a yıkılım olamayacağından, piruvat’a kadar yıkılacağından, önceki 2 ATP’ye ilave olarak net kazanç 1 mol NADH2’nin karşılığı 2.5 mol ATP olarak alınırsa : 2 mol ATP ve 2 mol NADH2’dir yani, toplamda net kazanç ATP cinsinden 7 mol ATP’dir.

Eğer şartlar ANAEROBİK ise, yani Anaerobik glikoliz var ise Laktat’a yıkım olacağından net kazanç : sadece 2 mol ATP’dir. Yani mitokondrileri olmadığı için eritrositlerdeki bu minimum durumdur ( EYLÜL 1989 ve EYLÜL 1992 BİYOKİMYA TUS SORULARI ).

Fakat bu durum da, eritrosit’in oksijen ile olan ilişkisine göre değişmektedir. Aerobik glikoliz sonucu 2 mol Piruvat, oksijenli ortamda TCA’ya girecekse önce 2 mol asetil KoA oluşturacaktır. Burada da 2 mol NADH2 kazanılır yani 5 mol ATP değerindedir.

Hatırlanacağı gibi Glikolizde 3 önemli enzim tek yönlü reaksiyonları kataliz eder. Bunlar KİNAZ enzimleridir : Hekzokinaz ( glukokinaz ) , Fosfofruktokinaz ve PEP’den Piruvat oluşturan Piruvat Kinaz enzimleridir. Bu reaksiyonlar İRREVERSİBLE’dır.Aşağıdaki şekil’e bakılırsa, başka bir ifadeyle glikolizde tek yönlü reaksiyonlar kinaz enzimleri tarafından katalize edildikleri gibi, bu reaksiyonlar başka bir deyişle : iki glukoz arasındaki, iki fruktoz arasındaki ve iki piruvat arasındaki reaksiyonlardır.

Şekil 1 : Glikoliz

Aşağıdaki şekilde bu enzimler mavi zemin olarak gösterilmişlerdir.  Kısaca hatırlamak gerekirse glikolizde iki glukoz arasındaki reaksiyon, iki fruktoz arasındaki reaksiyon ve iki piruvat arasındaki reaksiyon tek yönlü yani irreversible’dır. Sarı zemin olarak gösterilenler ise reversible ( çift yönlü, tersinir ) reaksiyonları katalize eden enzimler olarak gösterilmişlerdir.

Şekil 2 : Glikoliz’de ve TCA’ya girişte enerji durumu.

Laktik Asidoz :

Piruvat, koenzim NADH2 yardımıyla laktat’a indirgenmektedir. Anaerobik glikoliz’de gidilecek son durak laktat’dır. Laktat oluşumunun en belirgin olduğu yer kas dokusudur. Bunun dışında elbette eritrositler, lökositler, renal medulla, testis gibi dokularda da laktat oluşur.

Glikolizde GA-3F DHG enzimi ile oluşan NADH2, laktat oluşumunda harcanmaktadır ve ileri derecede yoğun egzersizlerde kas hücreleri içinde laktat düzeyi artar, hücre içi asidoz oluşur, kas krampları oluşur.

Kasda biriken laktat, kana oradan da karaciğere geçerek glukoneogenez’e girer.

Kanda laktat artışı aslında iyi bir şok göstergesidir. Şok aslında kan akımının ani olarak azalmasıdır. Burada azalan oksijen’dir. Buna miyokard enfarktüsü, pulmoner emboli ve aşırı kanamalar neden olabilir. Böylece dolaşım sistemi kollapsı yani şok meydana gelir. Oluşan laktik asidoz en çok hipoksik olan tiptir. Daha az oluşan laktik asidoz tipi ise metabolik olandır. Hipoksik laktik asidoz’a adından da anlaşılacağı gibi en çok oksijen’in dokulara girişini engelleyen faktörler neden olurlar. Kanserlerde ve karaciğer harabiyetlerinde vs. ise metabolik tip laktik asidoz görülür.

Şekil 3: Laktat oluşumu ve etkileri.

Anlaşılacağı üzere glikolizde oluşturulan NADH₂ / NAD⁺ oranı çok önemlidir. Tıpkı hücre içi ADP düzeyinin o hücrenin enerji açığı olduğunu göstergesi olduğu gibi, NADH₂ / NAD⁺ oranının da laktat oluşumuna direkt olarak etkisi vardır. Sözgelimi hücre içinde NADH2 çoksa reaksiyon yönü piruvat’tan laktat oluşum yönüne doğrudur.

Karikatür 1 : Hücrenin enerji göstergeleri

Tam tersi olarak eğer hücre içinde NAD düzeyi artmışsa, bu sefer de reaksiyon laktat oluşturamaz hatta daha önce oluşanlar bile piruvat formuna dönerler. Birçok dokuda NADH₂ / NAD⁺ oranı birbirinden farklıdır. Bu oran artarsa hücre içinde laktat oluşur, azalırsa hücre içi laktat’ı da azalır. Bu oran bazı organlarda diğerlerine göre daha fazladır ve o organlar, dolayısıyla laktat oluşumuna daha elverişlidir. Örneğin kas dokusu böyledir.

Karikatür 2 : Karaciğerin laktat doygunluk düzeyi.

Bazı dokularda da laktat oluşumuna tahammül gösterilemez hatta, başka dokularda oluşup kana geçen oradan da bu dokulara gelen laktat, glukoneogenez yoluna sokulur. Bu dokulara örnek karaciğer ve kalp dokularıdır. Hatta kalp ve karaciğerde NAD daha fazla olduğu için, vücudun oksijensiz kaldığı durumlarda bu fazla NAD, bu organlarda anaerobik glikoliz’in de teminatı durumundadır. Bununla birlikte glukoneogenez ( GNG )’in neredeyse tamamının görüldüğü karaciğerde, laktat glukoza dönüşerek pH’yı düzeltir. Fakat karaciğer’in de bu kompansatris gücü sonsuz değildir. Laktat düzeyi kanda 2 mmol/L üzerine çıkıncaya kadar karaciğer bu işlemi başarıyla yapar, fakat kanda laktat 2 mmol/L düzeyi geçince karaciğer artık laktat’a GNG için kapılarını kapatır. Yukarıdaki karikatür de bunu anlatmaktadır.

Şekil 4 : Karaciğer, kalp ve kas dokularında NADH2/ NAD oranları.

1,3 BPG ve 2,3 BPG dengesi :

Glikoliz’de oluşan ara bileşik olan 1,3 BPG, çok önemli fonksiyonlar üstlenir. Özellikle eritrositlerde Hemoglobin’in Oksijen ile muhabbetini artırır. Sadece fosforun bağlandığı karbon farkı olan 1,3 BPG ile 2,3 BPG, birbirlerinin molekül izomerleridir, bu durum eritrositlerde çok önem arzeder.Aslında 2, 3 BPG, eritrositlerde glikolizin yan ürünü olmasına rağmen, çoğu zaman çok önemli olan hemoglobine OKSİJEN bağlanmasını daha da doğrusu hemoglobine oksijen bağlanamamasını kontrol eder ( EYLÜL 2003 BİYOKİMYA TUS SORUSU ).

Şekil 5 : 1,3 DPG’dan  2,3 DPG’a geçiş.

Yukarıdaki şekilde soldaki kırmızı ok ile işleyen reaksiyon normal şartlardaki reaksiyon iken, sağdaki şekildeki mutaz enzim hakimiyetinde geçen reaksiyon ise, yüksek irtifalara çıkıldığında havadaki oksijen azaldığında meydana gelen hakim reaksiyondur.Yüksek irtifalara çıkıldığında görüldüğü üzere eritrositlerde 2 mol ATP kazancı olamaz, böylece ne kar ne ziyan olarak glikoliz sürdürülür. Çünkü burada dokulara bir an önce oksijeni bırakabilmek daha hayati önem arzetmektedir. Bu durum aşağıdaki şekilde de sol tarafta gösterilmiştir. Aşağıdaki şeklin sağ tarafında oksijen bağlayabilen bir hemoglobin’in temsili resmi  ve oksijen bağlanma durumunu engelleyen 2,3 DPG’ın hemoglobindeki bağlanma bölgesi ( iki beta globin arası ) gösterilmiştir.

Şekil 6 : 1,3 DPG ‘dan  2,3 DPG’a  geçiş ve oksijen bağlanamaması.

Basitçe hatırlamak için aşağıdaki şekilde hemoglobin temsili yapısı, hemoglobindeki globin zincirindeki heme yapısı ve oksijen’in, karbondioksit’in, proton’un, karbonmonoksit’in zincire bağlanma yerleri detaylı olarak gösterilmiştir. Dikkat edilirse hepsinin bağlanma yerleri birbirinden farklılık gösterir. Sadece oksijen ile karbonmonoksit aynı yere bağlanırlar. Eğer ortamda 2,3 DPG var ise yani yüksek rakımlara çıkılmışsa, 2,3 DPG ; pozitif yükleri olan iki beta zinciri arasındaki bölgeye yerleşir.Bu yük değişimi oksijen’in bağlanmasını güçleştirir.

Şekil 7 : Hemoglobin, globin’deki heme yapısı ve zincire bağlanan moleküller.

Yüksek irtifalara çıkınca eritrositlerde meydana gelen anaerobik glikolizde oluşan  1, 3 BPG, durumu kurtarmak için 2,3 BPG’a dönüşür ve bu molekül, hemoglobin beta zincirleri arasındaki bölgeyi kaplar ve hemoglobine oksijen bağlanmasını engeller. Yüksek irtifalara çıkmayı vücut tehlike olarak algılar çünkü yüksek irtifalarda oksijen azdır, bu az olan oksijen’in yeterince dokulara dağılımı gereklidir. Burada da devreye 2,3 BPG girer, oksijen hemoglobine kuvvetli tutunamaz, hemen dokulara diffüz olur. 1,3 BPG’ın tıpkı süper kahraman gibi ihtiyaç olduğunda süper elbisesini giyip, 2, 3 BPG olur. Yani 1, 3 BPG kendi halinde bir moleküldür, fakat tehlikeli durumlarda derhal bir MUTAZ adı verilen telefon kulübesinde kıyafetini değiştirerek süper 2,3 BPG olur.

Karikatür 3 : Süper 2,3 BPG.

Fakat 2,3 BPG da, yukarıda da belirttiğimiz gibi öyle her ortamda sentezlenemez, yani ortaya çıkamaz. Sentezlenebilmesi için kişinin deniz seviyesinden ayrılıp yüksek irtifalara, dağlara çıkması gerekir. Görüldüğü gibi 2,3 BPG’ın Oksijene affinitesi çok daha azdır, daha doğrusu 2,3 BPG, deoksijene Hemoglobini çok kuvvetli bağlar, yapıştı mı bırakmaz, Hemoglobin’e oksijeni bağlattırmaz. Aşağıdaki şekilde de bu durum gösterilmiştir. 2,3 BPG hemoglobinin beta zincirindeki pozitif yüklü aminoasitlerin oluşturduğu bölgeye kendisi bağlanarak, yük dağılımını değiştirir ve deoksijene hemoglobin oluşturur. 2,3 BPG’ın bir faydalı görevi de özellikle oksijenin dokulara çabuk bırakılmasını gerektiren durumlarda ( dağlara tırmanma ), 2,3 BPG artışı olur ve bu da oksijeni hemoglobinde tutmaz, dokulara bırakır.

Karikatür 4 : 2,3 BPG

Eritrosit içindeki glikolizde oluşan 2,3 BPG yolu eritrositlere özgüdür. Böylece hemoglobinin oksijeni bağlaması kontrol edilir.Bir kez daha yinelemek gerekirse yüksek irtifalarda, konjenital kalp hastalıklarında, anemi’lerde, kronik akciğer hastalıklarında ve fosfat’dan zengin durumlarda 2,3 BPG sentezi artar, hemoglobin oksijeni bağlayamaz, nefes darlığı hissedilir. Yani 2,3 BPG, oksijeni kovar. Asidoz’da ve Glikoliz’i durduran olaylarda, glikoliz’in yan ve ara ürünü olduğu için 2,3 BPG sentezi azalır.

Glikoliz’i durduran en önemli 3 neden : İnsülin etkisizliği, glukagon hakimiyeti ve glukoneogenez’dir. Ayrıca hücre içindeki fosfat’ın azalması da 2,3 BPG sentezini azaltır.

Tekrar PEP basamağına dönersek: Piruvat oluştuktan sonra Mitokondri içindeki TCA’ya giriş olur.

Şekil 8 : Piruvat’ın TCA’ya girişi.

Piruvat mitokondri içersine proton ile birlikte girer. Piruvat’ın mitokondri içine girişi engellenirse TCA oluşamaz. Bunu başaran bileşikler etil maleimid ve hidroksi cinnamate’dır.

Şekil 9 : Piruvat’ın TCA’ya girişinin engellenmesi.

PDH :

Piruvat ( Prv. ), yukarıdaki şekilde gösterildiği gibi mitokondri içine proton ( H+ ) ile kolaylaştırılmış simport ile veya özel bir taşıyıcı ile girebilir. Piruvat mitokondri içinde iki karbonlu Asetil KoA’ya dekarboksile olur. Asetil KoA da TCA’ya giriş bileti’dir. Bu reaksiyon Mitokondri iç zarındaki PDH ( Piruvat Dehidrogenaz Enzim Kompleksi ) ile olur ( EYLÜL 1987 BİYOKİMYA TUS SORUSU ).Özellikle Asetil KoA’nın derişiminin artması PDH enzimini allosterik olarak inhibe eder, aksi olarak da Piruvat Karboksilaz enzimini de aktive eder.

Şekil 10 : PDH Enzim Kompleksini başlıca aktive ve inhibe edenler.

PDH enzim kompleksi,aslında 3 enzimden oluşur : PDH, Dihidrolipoil Transasetilaz ( DHLTA, lipoik asit ), Dihidrolipoil Dehidrogenaz ( DHLDH ).

PDH enzim kompleksi yaptığı iş yönüyle çok önemli bir konum arzeder. Çünkü eğer bu enzim kompleksi olmasaydı, Mitokondri içi, Piruvatı substrat olarak kullanamazdı, dolayısıyla karbohidratlar TCA siklusuna giremezdi, laktat artardı. Aşağıdaki şekilde enzimin çalışması gösterilmiştir. PDH, NADH ve Asetil KoA tarafından inhibe edilir, Tiamin eksikliğinde de ( örneğin Beri beri, Wernicke – Korsakoff gibi ) PDH zaten görev yapamaz ( EYLÜL 2001 ve NİSAN 2002 ve MAYIS 2011 BİYOKİMYA TUS SORULARI ). Yani Vücutta enerji fazlaysa PDH inhibe olur, TCA yavaşlar. Açlıkta dolaşımdaki serbest yağ asidi konsantrasyonu artar, bu da PDH’ı inhibe eder. Böylece Karbohidrat kullanımı azaltılır.

Karikatür 5 : PDH inhibisyonu.

Aşağıdaki şekilde ayrıca BERİ BERİ hastalığı ( Vitamin B1 eksikliği ) da PDH’ı nasıl etkileyebilmektedir o da gösterilmiştir. Ayrıca Tiyamin eksikliğinde görülen BERİ BERİ hastalığının belli başlı bulguları da şekilde gösterilmiştir. Dikkat edilirse Thiamin yani Vitamin B1, PDH enziminin bir yapıtaşıdır.

Şekil 11 : Beri Beri hastalığında PDH enzimi.

PDH birçok şekilde inhibe de olabilir. PDH kompleksinde bir mutasyon sonucu LEIGH SENDROMU yani subakut nekrotizan ensefalomiyelopati denen progressif nörolojik hastalık bunlardan biridir. Örneğin Beri Beri hastalığı bunlardan biridir. Toksik elementlerde civa ( Hg) ve Arsenik ( As ) bunlardan biridir. Arsenik değerliği +5 ile +3 ve -3 olabilen periyodik cetvelin 5A grubunda bulunan toksik bir elementdir. Arseniğin 3 değerli olanlarına Arsenit denir. Arsenik metillenirse toksik olmaz. Örneğin bazı deniz mahsüllerinde bolca metil arsenik vardır ve yenirse insanda bir toksik tablo ortaya çıkarmaz.

Arsenik daha önceki konuda da görüldüğü gibi glikolizin 7. Basamağında 1,3 – BPG’ın 3 –PG’a dönüşümünü inhibe etmekte ve ATP sentezini azlatmaktaydı. Fakat Arsenik ile ilgili şu nokta unutulmamalıdır. Arsenik zehirlenmelerinde asıl hedef lipoik asit’tir çünkü arsenik, lipoik asidin tiyol ( – SH ) gruplarına kuvvetlice bağlanır.Yani organizma’da hangi enzimler koenzim olarak lipoik asidi kullanıyorlarsa o enzimler arsenik tarafından inhibe olurlar. Lipoik asidi kullanan ve dolayısıyla arsenik toksisitesine maruz kalabilecek olan enzimler : Piruvat Dehidrogenaz, alfa ketoglutarat dehidrogenaz ve dallı zincirli amino asitlerin oksidatif dekarboksilasyonunu  sağlayan alfa keto asit dehidrogenaz’dır.

Bunlarla PDH inhibe olursa ( Beri Beri ile veya As ile veya Hg ile ), Piruvat birikir. Alkoliklerde Tiyamin eksikliği görülebileceğini de unutmamak gerekir. Piruvat birikince TCA’ya değil, Laktik aside yıkılmaya meyil gösterir. Bu kişilerde glukoz yüklemesi yapılırsa Laktik asidoz artar, bu durumdan en çok beyin etkilenir ve Nörolojik semptomlar bulgular kendini gösterir. Psikomotor gerilik öne çıkan bulgudur.Beyin bu durumda hem TCA’dan enerji elde edemez hem de asidoz tablosu içinde kalır. PDH enzim eksikliği uzun süreli olursa özellikle yenidoğan ölümleri kaçınılmaz hal alır. Karbohidrat yüklemeleri iskelet kaslarında koordinasyon bozukluğuna ( ataksi ) yol açabilir. Bu nedenle yapılabilecek tek tedavi şekli olan semptomatik tedavilerinde de diyette karbohidrat verilmez, yağdan zengin gıdalar verilir.

PDH enzim kompleksi, 5 adet koenzim kullanır.

Bunlar:Tiyamin piro fosfat ( TPP ), lipoik asit, NAD, FAD ve Koenzim A SH’dır. Enzim tepkimeye girdikten sonra da üretilenler karbondioksit, Asetil KoA ve NADH2’dir. Tiyamin ve niyasin eksikliği var ise PDH enzim kompleksi çalışamaz ve bu durum nedeniyle oluşan özellikle beyinde TCA azlığı, enerji yoksunluğuna neden olacağından beyin fonksiyonlarında yavaşlama yapmaktadır.

Bilindiği gibi her enzimin hücre içinde bir fosforlanmış hali vardır bir de fosfordan arınmış hali vardır. Birinde inhibe olurken diğerinde aktive olur. Bunları sağlayan da yine 2 enzimdir ( fosforilaz, fosfataz ).

Karikatür 6 : PDH’ın fosforlanma ile inhibisyonu.

PDH enzim kompleksinin inaktif halde bulunması için fosforlanması lazımdır. Aktif hale geçebilmek için de fosfat’ından kurtulması lazımdır. Yani Fosforilaz enzimi enzimi inaktive ederken, protein fosfataz enzimi ise PDH enzim kompleksini aktive eder. Protein fosfataz’ın aktif hale geçişini sağlayan kalsiyum’dur. Dolayısıyla kalsiyum, PDH’ı aktive eder, yani kalsiyum, TCA’ya girişi aktive eder, enerji üretimini destekler.

Burada piruvat dehidrogenaz’ın yapısına giren lipoik asidi ( koenzim ) de hatta Koenzim A’yı da biraz incelemekte fayda görmekteyim.

LİPOİK ASİT :

Lipoik asit dışarıdan da alınabilir, vücutta da mitokondri’de oktanoik aside 2 adet kükürt ilavesiyle sentezlenebilir, 8 karbonludur. PDH enzim kompleksini temsili olarak çizerken temsili olarak da lipoik asit gösterilmiştir. Şekli incelerken okside lipoik asidin ( lipoat) halka yapı içerdiğine, dihidrolipoik asidin ise halka yapı içermediğine dikkat ediniz.En önemli özelliği antioksidan olması ve hem lipofilik hem de hidrofilik olmasıdır. Lipoik asit serbest radikal hasarını bertaraf etmek için vitamin E ve C’nin rejenere edilmesinde görev alır ve bu serbest radikaller konusunda da anlatılacaktır. Lipoik asit okside olabilir veya redükte olabilir ( dihidrolipoik asit ).

Şekil 12 : PDH enzimindeki Redükte Lipoik Asidin görevi ve açil bağlanma yeri.

Lipoik asit oral yolla alınırsa barsaklardan tamamına yakını emilir. Metabolize olmasında S-metilasyon ve Beta oksidasyon kulanılır. Lipoik asidin esas fonksiyonu AÇİL taşıyıcı olmasıdır.  İki enzimin yapısında bulunur, bunlardan bir tanesi şu anda bahsini gördüğümüz piruvat dehidrogenaz enzim kompleksi ve diğeri de TCA siklusunda göreceğimiz alfa ketoglutarat dehidrogenaz enzim kompleksidir.Lipoik asidi gıdalarla yeterince almak vücut için çok önemlidir ve en çok ıspanak’da bulunur. Ispanaktaki miktarına  en yakın bulunduğu hayvansal gıda ise böbrek’dir.Lipoik asit hücreye genellikle difüzyonla girer.

Karikatür 7 : Açil taşıyan Lipoik asit.

Koenzim A :

Koenzim A, bir vitamin B5 türevidir fakat nükleotid yapısındadır. Isıya dirençli bir moleküldür. Eğer bir reaksiyonda açil veya asetil grubu transferi var ise burada koenzim A görev alır, zaten A harfi de Açil grubunu belirtmek için adlandırılmasında kullanılmıştır. Koenzim A yapısında kükürt ( S, sülfidril veya tiyol ) vardır ve açil grubunu üzerine alan da budur, böylece açil grubunu transfer olacağı ana kadar üzerinde taşır. Aşağıda basit olarak bir koenzim A molekülü tasvir edilmiştir.

Şekil 13 : Şematik Koenzim A yapısı.

Yukarıdaki şekilde de görüldüğü üzere Koenzim A yapısı 5 temel yapının birleşmesinden oluşmuştur. Bunlar : Beta merkapto etanolamin ( tiyoetanolamin ), yapısında beta alanin ve dimetil bütirik asit bulunan pantotenik asit ( vitamin B5 ), Riboz-3 pirofosfat ( Ribozun 3. Karbonuna bağlı 2 adet fosfat ) ve Adenin yapısı bu muazzam Koenzim A yapısını oluşturmaktadır.

Soru 1 : Koenzim A yapıtaşları sorusu

Bu yapının içine giren pantotenik asit ( vitamin B5 ), en çok hayvansal gıdalarda bulunur. Pantotenik asit, asetil kolin sentezinde de görev alır. Pantoten yunanca ‘‘her yer‘’ demektir yani heryerde bolca var demektir ama hayvansal gıdalarda daha çoktur. Bitkilerden de mercimek’te çoktur.

Bir ( 1 )  Mol Glukoz ile Glikolize girilirse:

Glukoz başına fosfat sayısı 7 mol’dür ( net 7 ATP kazanç ).

Eğer ortam anerobik ise ve Laktat’a kadar yıkılırsa net kazanç 2 ATP’dir.

Eğer aerobik ortamda piruvat’dan Asetil Koa yoluyla  TCA ( Krebs ) siklusuna girerse net kazanç 30 ATP’dir ve bu durumda toplam net kazanç 38 ATP’dir.

Gerek glikolizde gerek Krebs siklusunda gerekse vücutta cereyan eden tüm metabolik yollarda oluşan enerjilerden ATP ve GTP için hazır enerji tanımını kullanabiliriz. Çünkü bunlar hemen enerji olarak ortaya çıkarlar, buna karşın yine aynı metabolik yollarda oluşan NADH2 ve FADH2 için durum aynı değildir.Bunları, vücudun enerji olarak kullanılabilmesi için NADH2’nin önce mitokondri içine alınmaları gereklidir. Çünkü bu halleri ile ATP değillerdir.

Soru 2 : FAD sorusu

Hem içeri alınan NADH2 hem de zaten mitokondri içinde bulunan, sitozolde bulunamayan FADH2, mitokondri iç zarında elektron transportuna ve oksiatif fosforilasyona katılarak ATP haline gelirler.

 

Şekil 14 : Mitokondri- Sitozol arasında Glisero fosfat mekiği ve Malat mekiği.

FADH2’nin mitokondri içersine girmeye ihtiyacı yoktur çünkü sadece mitokondri içinde bulunmaktadır, ve sitozolde FADH2 yoktur. Elektron transportu ve oksidatif fosforilasyona katıldıktan sonra, bir ( 1) mol NADH2’nin karşılığı 2.5 ATP iken, 1 mol FADH2’nin karşılığı ise 1.5 ATP’dir.

NADH2 mitokondri içine ya glisero fosfat mekiği ile ya da Malat mekiği ile girer. Yukarıdaki şekilde her iki mekik ayrıntılı olarak tasvir edilmiştir.

Gliserofosfat mekiğinde Dihidroksi aseton fosfat ve Gliseraldehid 3 fosfat arasındaki mekik ile sitozoldeki NADH2 ( karşılığı 2.5 ATP ), mitokondri içine biraz zararla FADH2 ( karşılığı 1.5 ATP ) şeklinde girer.

Karikatür 8 : NADH2’nin tercihleri 

Malat mekiğinde ise zarar yoktur. Yani sitozoldeki NADH2, mitokondri içine de NADH2 olarak girer. Burada önemli bir detay da Malat mekiğinde görev alan Malat, alfa keto glutarat, Aspartat, Glutamat, NAD⁺, NADH2, okzalo asetat moleküllerinden sadece iki tanesi mitokondri zarlarını geçemez.

Karikatür 9 :Okzaloasetat ve NADH2

Bunlar okzaloasetat ve NADH2’dir. O nedenle de başka moleküllere çevrilerek mitokondri içine gireler veya mitokondri dışına çıkabilirler. Bu durum yukarıdaki şekilde detaylı olarak tasvir edilmiştir.

Şekil 15 : Glisero fosfat mekiği ve Malat mekiği’nin organlara göre dağılımı.

Yukarıdaki şekli iyi incelerseniz, sitozoldeki NADH2’nin mitokondri içine farklı 2 yolu kullanarak girip, elektron transportu ve oksidatif fosforilasyona katılması halinde, enerji kazanımları da farklı olacaktır. Glisero fosfat mekiğini kullanırsa 2 mol NADH2, 2 mol FADH2’ye dönüşecek yani enerji olarak zarar edecek, sonuçta sadece 3 ATP elde edilecektir. Diğer yol olan Malat mekiği kullanılırsa ise 5 ATP elde edilecektir.

Karikatür 10 : Organların kullandığı mekikler

Enerji’nin ihtiyacına ve ani kullanılmasına ve hayatiyetinin önemine göre de beyin ve çizgili kas dokusunda gliserofosfat mekiği bulunurken, enerji zararına tahammül edemeyecek olan kalp ve böbrek dokusunda ise malat mekiği bulunmaktadır.

Şekil 16 : PDH’ın katalizlediği reaksiyon.

Yukarıdaki reaksiyonda Asetil KoA oluşurken bir molekül de CO2 çıkışı olur. Karbondioksit çıkararak karbonu eksilmiş piruvat kalıntısını üzerine alıp taşıyan, reaksiyona sokan Tiyamin Piro Fosfat’dır ( TPP ). Bu kalıntıdan Asetat oluşumunu üzerine alan ise Lipoik asitdir. Lipoik asit asetil kalıntısını üzerine alır ve onu ileri reaksiyonlara sokmak için üzerinde taşır. Tıpkı bir 400 metre bayrak yarışı gibi bayrak elden ele teslim edilir.

Karikatür 11 : Bayrak yarışı 

Enzimin koenzimi olan Koenzim A ( KoA-SH ), asetil kalıntısını, lipoik asit’den kendi üzerine alır. Böylece bayrak KoA’ya geçmiş olur. Bunun adı da Asetil KoA olur. Asetil kalıntısını KoA’ya vererek indirgenen lipoik asit, bu hidrür iyonunu FAD’ye vererek onu indirgenmiş FADH2 haline getirir, FADH2’nin hidrür iyonları da NAD’yi indirgeyerek NADH2 haline getirirler. Yukarıdaki şekilde gösterilen PDH’ın katalizlediği reaksiyonda da bu durum anlatılmaktadır.

Anaerobik Glikoliz’in 11. Reaksiyonunu katalizleyen Laktat Dehidrogenaz ( LDH ) enzimi bir sitoplazma marker’ıdır ve rutin biyokimya analizlerinde de sıkça kullanılır. Şimdi LDH enzimini daha ayrıntılı olarak görelim.

Çinko’lu  LDH ( Laktat Dehidrogenaz ) :

LDH,  Çinko içeren  bir enzimdir. Neredeyse tüm dokularda bulunur. LDH’nın en çok arttığı durum  Pernisiyöz anemi ve hemolitik bozukluktur ( MAYIS 2011 BİYOKİMYA TUS SORUSU ).  Laktat Dehidrogenaz ( LDH )’ın , 5  izoenzimi vardır. LDH 1 ( HHHH ), LDH 2 ( HHHM ), LDH 3 ( HHMM ), LDH 4 ( HMMM ), LDH 5 ( MMMM ). H ( heart ) ve M ( Muscle ) olan iki yapı bir araya gelip tetramer bir yapı olabilirse, LDH efektif olur, aksi takdirde LDH işlevsizdir. Sonuçta LDH enzimi bir tetramerdir. Aşağıdaki şekilde LDH’nın 5 farklı izoenzimi ve serumdaki oranları tasvir edilmiştir.Görüldüğü üzere hastalık olmayan durumlarda serumda en fazla LDH 2 vardır.

 

Şekil 17 : LDH izoenzimlerinin serumdaki oranları ve bulundukları yerler.

Yukarıdaki şekilde LDH izoenzimlerinin serum oranları ve menşeyleri gösterilmektedir, dikkat edilirse özellikle de LDH 5, MMMM yapısında olduğundan sadece KARACİĞER’de bulunur ve sadece karaciğer hastalıklarında artar.

Oysa LDH 4, HMMM yapısındadır ve Karaciğer ile birlikte iskelet kaslarında da bulunur.

Kalp kasında ise en çok LDH1, sırasıyla LDH2 ve LDH 3 vardır ( EYLÜL 1993 BİYOKİMYA TUS SORUSU ).

Yoğun bir egzersiz yada sıkı bir antrenman sonrası serum LDH düzeyi % 50 kadar artabilir.

Çeşitli hastalıklarda ( enfeksiyöz, inflamatuvar, malign vs. ) vücutta oluşan sıvı birikimlerinin eksüda ve transüda ayrımında da LDH enzimi ölçümü kullanılır. Sıvı’daki LDH, serumdaki LDH’a oranlanmalıdır. Bu oran 6/10 oranından fazla ise sıvı eksüda’dır veya hemorajik bir sıvıdır. Beyin omurilik sıvısında artan LDH düzeyi menenjit bulgusu olabilir.

Karikatür 12 : Çinkolu LDH

Aşağıda alkali bir pH’da LDH izoenzimlerinin elektroforetik dizilimleri gösterilmiştir. PMS ( Phenazine Meto Sulphate ) ve onun uyardığı NBT  ( Nitro Blue Tetrazolium ) ilavesiyle mavi renge boyanmasıyla elde edilen şematik görüntüleri tasir edilmiştir. Kalp ve karaciğer bantları arasındaki sınır daha açık belli olsun diye kalp için kırmızı ve karaciğer için mavi tonları renkler kullanılmıştır. Normalde hepsi mavi renkli olurlar.

Elektroforezde en hızlı göç eden LDH 1’dir. En yavaş göç eden ise LDH 5’dir. Sağlıklı ve normal bireylerde major izoenzim LDH 2’dir. Normalde sağlıklı bireylerde LDH 2 > LDH 1 olmasına rağmen, Akut MI ( Akut Miyokard Enfarktüsünde )’de LDH 1 > LDH 2 olur ki buna da flipped pattern denir ve Akut MI göstergesidir.Bu durum hemolizli serumlarda yanıltıcı olabilir.

Pulmoner olaylarda LDH 3 artışı vardır. LDH 5, LDH 4’e göre daha çok karaciğere spesifiktir. Müsküler distrofilerde de LDH 5 artar. Aslında LDH 6 da vardır ve bunun adı da ALKOL DEHİDROGENAZ’dır. Aterosklerotik Kardiyovasküler yetersizliklerde  LDH 6 görülür. LDH, Ig G ve A ile kompleks yapabilir ve elektroforezde LDH 3 ile 4 arasında göç eder. Elektroforez immünoinhibisyon metodunun yardımıyla yapılır.

Şekil 18 : Serum LDH izoenzimlerinin elektroforezi ve boyanmaları.

Karaciğer harabiyetlerinde daha çok LDH 5 artarken, MI’de LDH 1 ve 2 artmaktadır.

LDH ‘nın M subunitlerinde defekt var ise: LDH yetersizliğinden  bahsedilir : Aşağıdaki şekilde elektroforez’de M subüniti katkılı izoformlar yok gibi çizilmiştir. Sadece tam olarak effektif H subüniti olan LDH 1 çizilerek gösterilmiştir. LDH yetersizliği bulunan hastalarda egzersiz intoleransı, kas krampları, egzersiz sonrası koyu kırmızı idrar çıkarma, Eritamotöz Rashlar ve Tip 5 glikojen depo hastalığını taklit eden bulgular görülür ve serumda CK düzeyleri artar. Aşağıdaki şekilde LDH yetersizliği kliniği’nin bazı bulguları karikatürize edilmiştir.

Şekil 19 : LDH yetersizliği.

LDH aynı zamanda Anaerobik glikolizde önemli bir enzimdir.Piruvat’ın Laktat’a dönüş basamağını tersinir olarak kataliz eder. Piruvat laktat’a, laktat da piruvat’a aynı enzimle çevrilir. Özellikle LDH 5, Malign Lenfomalarda ve Akut hepatitlerde artar. LDH enziminin kaynağı kalp ve karaciğer eritrositleridir. Her hücrenin sitoplazmasının marker enzimi olan LDH, oksijensiz glikolizde çok önemlidir.

LDH analizinin belli aralıklarla seri ölçümleri, hemolitik ve megaloblastik anemilerin ve trombotik trombositopenik purpura’nın, akciğer hastalıklarının, lenfomaların takiplerinde değerli olabilmektedir.

 

Şekil 20 : Anaerobik glikolizde LDH fonksiyonu.

LDH’nın bir başka fonksiyonu da Sistein’den S ( kükürt ) uzaklaştırılmasıdır : Sistein’in Tiyopiruvata dönüşümü karaciğer ve böbrekte Transaminazlarla olur. Tiyopiruvatın H2S’den kurtulması ya önce sadece piruvata dönüşerek olur ya da LDH enzimi ile Tiyopiruvatın Laktat’a dönüşmesiyle olur. Bu reaksiyon da LDH enzimince katalizlenir.

Şekil 21 : Sistein’den kükürt uzaklaştırılması.

Serumdaki LDH’nın otoanalizörlerde veya spektrofotometrik ölçümlerinde : Substrat olarak Piruvat  ve NADH  ( LDH-P, pH : 7.4, 3 kat daha hızlı ölçüm yapar, daha hassastır fakat linearitesi  kaybolur ) veya tersi olarak Laktat ve NAD + ( pH : 8.9 ,  1/3 daha yavaş ) kullanılır. Laktat’dan piruvat’a olan ölçüm ( LDH-L ), alkali pH’da ölçüm yapar fakat yine de LDH-L, daha fizyolojik şartlarda bir ölçümdür çünkü LDH2 ve LDH1’in baskın olduğu serumlarda en doğru sonucu verir. Normalde 5 izoenzimi ( LDH1,2,3,4 ve 5 ) olan LDH’da serumda en çok bulunan LDH2’dir. LDH-P ise daha ziyade LDH4 ve LDH5’in baskın olduğu serumlarda doğru sonuç vermektedir.

Karikatür 13 :  LDH çeşitlerini nasıl ölçelim ?

Eritrosit içinde seruma göre 150 kat daha fazla LDH vardır ve serum LDH ölçümü hemolizli serum kabul etmez.

En labil izoenzim LDH 5’dir. LDH 1 ise, ısıya duyarlıdır ( 65 santigrat derecede 30 dakikada tahrip olur ). LDH 4 ve 5 ise , ısıya karşı dayanıklıdır. Önce total LDH aktivitesi ölçülür, daha sonra seruma ısı inaktivasyonu yapılır, tekrar total LDH aktivitesi ölçülür, aradaki fark : LDH 1’dir.

Karikatür 14 :  LDH 1 ölçümü 

Pıhtılaşmada görev yapan trombositlerin içersinde de yoğun olarak LDH vardır ve pıhtılaşma anında trombositlerden dışarı salınırlar. Bu nedenle plazmada LDH ölçümü çok sağlıklı olmayabilir. Çünkü plazmada ‘’ platelet’den zengin plazma ‘’ kısmı denen bir kısım vardır ve bu ölçümü yanıltır.

Karikatür 15 :  Plazmada LDH fazladır çünkü Plateletler de salar

Bu nedenle LDH en ideal olarak serumda ölçülür. Serum oda ısısında 3 gün boyunca bu ölçüm için stabildir. LDH ölçülecek serum buzdolabına veya -20 santigrat dereceye konulursa bu ölçüm için stabilitesini kaybeder. Eritrositlerdeki  LDH seruma göre 150 kat fazla olduğundan, serumda LDH ölçümü ile in vivo olarak  hemoliz belirlenir.

Şekil 22: LDH ölçüm metodları

LDH ölçümünde en yaygın substrat olarak Laktat kullanılmasına rağmen, Laktat’a ilave olarak, Alfa Hidroksi Bütirat da kullanılabilir. Alfa HB, bilindiği gibi ketozlarda aşırı olarak üretilir ve birikir. Alfa Hidroksi Bütirat  ( Alfa HB ) kullanılırsa, bu substrat H subünitlerine affinite gösterdiğinden, LDH 5’i ölçmeyip, LDH 1’i ölçer. Tabi ki H subünit oranları itibariyle de LDH 2, 3 ve 4’ü de az da olsa ölçer ( Alfa Ketobütirat, Alfa HBDH enzimi ile Alfa HB’a dönüşür). Bu nedenle de Alfa HB dehidrogenaz enziminin diğer adı da LDH1’dir. Bu nedenle Alfa HB dehidrogenaz enzimini total LDH’ya oranlarsak, LDH artışı durumlarında LDH’nın orijini hakkında da bir fikir yürütebiliriz.

Karikatür 16 :  Alfa HB Dehidrogenaz ( LDH 1 )

LDH-L’nin referens aralığı 37 santigrad derecede 100 – 225 U / L ‘dir. LDH-P’nin referens aralığı ise çok daha yüksektir ( < 450 U/L ).

LDH , hücre ölümünü belirlemede de ( sitotoksisite ), doku hasarını belirlemede, doku hasarının erken göstergesi olarak kullanılabilir. Hücre yıkımının takip edilmesinde, özellikle kemoterapi alan hastalarda bu yıkımın takip edilmesi önemli olmaktadır. Böylece hücre ölümünü ölçülebilir bir veri haline getirebiliriz. Çünkü LDH aynı zamanda bir sitoplazma belirtecidir.Son ürün olarak oluşan kırmızı renkli FORMAZAN, 490 nm dalga boyunda ölçülür.

Şekil 23 LDH ölçüm metodlarından biri

LDH’yı artıran en önemli etkenler’den bir grubu da bazı tümöral durumlardır. Bunlar lösemi, lenfoma, testiküler tümöral durumlar ve Tümör lizis sendromu gibi hastalıklardır. Böbrek hastalığı, kas hastalıkları, karaciğer hastalıkları, miyokard enfarktüsleri, barsak ve akciğer enfarktüsleri, kompartıman sendromu, stroke (inme ) durumlarında, tüm hemolitik ( Megaloblastik anemi, G6PD eksikliği, yanıklar, kalp kapakları replasmanı sonrası vs. ) anemilerde LDH düzeyleri serumda artmaktadır.

Soru 3 : Haydi Bakalım !

Krebs Siklusu veya Sitrik Asit Siklusu :

Krebs Siklusu yada diğer adıyla Sitrik Asit Siklusu, yada diğer adlarıyla Trikarboksilik Asit Siklusu, TCA Siklusu, Amfibolik Siklus, Anabolik-katabolik Siklus diye değişik adlandırmaları olan bu döngü, Biyokimya’nın temel taşlarındandır. TCA siklusu anaerobik bir döngüdür ve son elektron alıcısı olarak oksijen’e ihtiyaç duyar.Yüce Allah (C.C.)’ın bu şahaserini çok çalışarak ortaya çıkaran Hans Adolf KREBS ve çalışma arkadaşı Alman asıllı Amerikalı biyokimyacı Fritz lipmann ( aşağıdaki diğer fotoğraf ), 1953 yılında bu keşifleri nedeniyle fizyoloji alanında Nobel Tıp Ödülünü almaya hak kazanmışlardır.

Şekil 24 : Sir Dr. Hans Adolf KREBS ve Dr. Fritz LİPMANN

Yukarıdaki şekilde KREBS’in resmi ve bilime yaptığı katkılar gösterilmiştir. Diğer fotoğraf ise Lipmann’dır. Bir daha dönmeyeceğimiz için çok kısa, 1-2 cümle ile glioksilat siklusundan bahsedersek :

Glioksilat Siklusu :

Glioksilat siklusu insanlarda olmaz. Bitkilerde, bakterilerde, protistalarda ve funguslarda olur. Prokaryotlarda TCA siklusunun tüm enzimleri mitokondri olamadığı için sitozolde yer alır ve plazma membranı da sanki mitokondri gibi davranır. İnsanlar ve hayvanlarda TCA siklusunda Yağ asitlerinden glukoz sentezi olmaz. Çünkü TCA’daki okzalo asetat( OAA ), glukoneogenez yoluna giremez. Eğer böyle bir şey olsaydı TCA siklusunda enerji elde edilemez, devamlı glukoz elde edilir, o da glikoliz’de daha az bir enerji elde edilmesinde kullanılırdı. Oysa prokaryotlarda aşırı enerji elde etmeye gerek yoktur. Bu amaçla da Yüce Allah (C.C.) prokaryotlara glioksilat Siklusunu koymuştur.

Şekil 25 : TCA ve Glioksilat Siklusları’nın farkları.

Prokaryotlarda Glioksilat siklusunda siklusda oluşan Okzalo asetat ( OAA ), rahatlıkla glukoneogenez yoluna girebilir. Böylece prokaryotlarda yağ asitlerinden, asetat’dan glukoz eldesi mümkün olabilmektedir. Yukarıdaki şekilden de anlaşılacağı gibi glioksilat siklusunda 2 mol Asetil KoA siklus’a değişik basamaklardan girmektedir, sonuçta her döngüde 1 mol de süksinat sentezlenir. Omurgalılar dışında tüm organizmalar, asetat’ı glukoz’a çevirebilmek için glioksilat siklusuna muhtaçtır. Glioksilat döngüsündeki İzositrat Liyaz ve Malat Sentaz enzimleri insan ve hayvanlarda yoktur.

Bu kısa bilgiden sonra yeniden TCA siklusuna dönebiliriz.

TCA’nın faydaları :

Asetil KoA 2 karbonlu olmasına rağmen yüksek enerji barındırır. Bu molekülü yıkarak enerji elde edilmesine neden olur.

Vücutttaki ATP üretiminin çoğu TCA siklusu yolu ile kazanılır ( % 60 ).

Amino asitlerin yıkımı ile ortaya çıkan karbonlar da TCA’ya girerler, oradan da glukoneogenez yoluna girerek glukoz oluştururlar.

HEME sentezinde çok gerekli olan süksinil KoA, TCA siklusunda ara basamakta üretilir.

Asetil KoA, Mitokondri zarını aşıp, sitozol’e çıkamaz, ancak kendisini Sitrat oluşturmak üzere feda ederse, mitokondri zarında sitrat üzerinden serbestçe geçiş sağlayabilir.

Malat, mitokondriye mübadele ile ( fosfat ve sitrat’a karşılık ) girebilirdiği gibi, mübadele ile de ( alfa KG’akarşılık ) çıkabilir. Aşağıdaki şekilde bu durum tasvir edilmiştir.

Şekil 26 : Mitokondri içersindeki TCA Siklusu ve sitozoldeki dönüşümler.

Yukarıdaki şekilden de anlaşılacağı üzere TCA siklusu mitokondri içinde olur. Aslında bu yol protein, yağ ve karbohidratlar’ın oksidasyonu için son ortak yol’dur. Mitokondride meydana gelenTCA Siklusu, Mitokondrideki elektron transport zincirini, elektronlarla ( NADH2, FADH2 ) en çok besleyen metabolik yoldur ( NİSAN 1991, 1994 BİYOKİMYA TUS SORULARI ).

Soru 4 : Haydi Bakalım !

Bu yol en çok karaciğerde olur. Bu nedenle karaciğer hastalıkları ve toksikozları sonucu gelişen karaciğer harabiyetlerinde TCA yolu ciddi olarak sekteye uğrar. Karaciğer harabiyetlerine en sık rastladığımız örnek özellikle obez hastalarda gördüğümüz karaciğer yağlanmalarıdır. Karaciğer yağlanmalarında TCA siklusu azalacağı için bu kişilerde bir enerji yoksunluğunun ortaya çıkması beklenen bir olaydır.

Şekil 27 : Karaciğerdeki TCA Siklusu ( MDHG : Malat Dehidrogenaz, İSDHG : İzositrat Dehidrogenaz , alfa KGDHG : alfa Ketoglutarat dehidrogenaz, SDHG : Süksinat Dehidrogenaz, OAA : Okzaloasetat, GTP : Guanozin Tri fosfat, NADH2 : Redükte Nikotin amid di nükleotit, FADH2 : Redükte Flavin Adenin di nükleotid ).

Aşağıdaki şekilde de mitokondri içinde sembolize edildiği gibi : Asetil KoA oluşumu 3 büyük kaynak olan karbohidratlardan, proteinlerin yapı taşı amino asitlerden ve yağ asitlerinin yıkımından ve hatta keton cisimlerinin yıkımından da karşılanmaktadır. Oluşan asetil KoA buradan enerji ihtiyacına göre Lipogenez yoluna da sapabilir, TCA siklusuna da girebilir.

Şekil 28 : Asetil KoA kaynakları.

Asetil KoA’nın oluşumu bu büyük yakıtların ( karbohidrat, yağ, protein, keton cisimi ) oksidasyonu sonucunda gerçekleşir. TCA siklusuna giren Asetil KoA’nın bundan sonraki yolculuğu, oksidatif fosforilasyon yönünde, ATP üretimini hedeflemektedir.

Şekil 29 : Asetil KoA’ların TCA siklusuna giriş kaynakları.

Bilindiği gibi TCA’ya giren KoA’ların 2 giriş yeri ve 2 kaynağı vardır. Bunlar Propil KoA olarak Süksinil üzerinden ve asetil KoA olarak da Okzalat üzerindendir. Aşağıdaki şekilde MALONAT, FLUOROASETAT ( fare zehiri ), ARSENİT bileşiklerinin TCA’yı blokladığı yerler gösterilmiştir. Aşağıdaki şekle dikkatli bakılırsa TCA enzimlerinin koenzim ve kofaktörleri de temsili olarak yerlerine uygun şekilde gösterilmiştir.Ayrıca KoA çıkış yerleri de iki yerde gösterilmiştir.

Şekil 30 : TCA Siklusu ve blokörleri.

Yukarıdaki renk tayfı şeklinde gösterilen TCA siklusu dikkatli incelenirse iç halkada TCA siklusunun asil üyeleri olan 8 molekül ( Okzaloasetat, sitrat, izositrat, alfa keto glutarat, süksinil KoA, süksinat, fumarat ve Malat ) gösterilmiştir, hemen dışındaki renkli halkada 8 molekül arasında geçiş sağlayan enzimler ( Sitrat sentaz, Akonitaz, İzositrat dehidrogenaz, Alfa keto glutarat dehidrogenaz, tiyokinaz, süksinat dehidrogenaz, fumaraz, malat dehidrogenaz ) yine renk tayfı şeklinde gösterilmiştir. Hemen bu halkanın dışındaki halkada ise reaksiyona dışarıdan girenler, bu enzimlerin kullandıkları koenzimler ve kofaktörler ( Asetil KoA, demir-kükürt, mangan, magnezyum, NAD, FAD, KoA, Tiyamin Piro fosfat, Lipoat ) gösterilmiştir. En dış katmanda siyah zeminde gösterilenler ise TCA siklusundaki enzimleri inhibe eden enzimlerden akonitaz inhibitörü FLUORO ASETAT, alfa keto glutarat dehidrogenaz inhibitörü ARSENİT ve süksinat dehidrogenaz inhibitörü MALONAT’dır.

Şekil 31 : TCA Siklusu ve blokörleri’nin başka bir şekilde gösterilmesi.

Yukarıdaki şekilde anlatılmak istenen bilgiyi incelersek : TCA siklusuna giriş basamağı olan ilk asetil KoA’nın ilave edildiği basamak olan ve sitrat sentaz enziminin katalizlediği basamak, Yağ Açil KoA tarafından, Sitrat tarafından, süksinil KoA tarafından inhibe edilir. Organizma’da enerji fazlalığı ( ATP, NADH,… ) varsa o durumda da bu basamak inhibe olur. Organizmada enerji fazlalığı varsa izositrat dehidrogenaz ve alfa keto glutarat dehidrogenaz enzimleri de çalışamaz, inhibe olurlar. Süksinil KoA fazlalığı da alfa ketoglutarat dehidrogenaz enzimini inhibe etmektedir. Yukarıdaki şekle tekrar bakarsak sol tarafta da süksinat dehidrogenaz enzimini süksinat ile yarışmaya girerek kompetitif inhibisyon yapan malonat molekülü karikatürize edilmiştir.

Tekrar TCA siklusunun ilk basamağına dönersek : Okzalo asetat ile Asetil KoA kondenzasyonundan SİTRAT ( ilk trikarboksilik asit ) oluşur. Bu oluşan SİTRAT çok önemli bir kontrol noktasıdır.

Şekil 32 : Sitrat’ın kontrolü.

Sitrat oluşması bir çok metabolik yolda kontrol sağlar. Oluşan Sitrat, glikolizin hız kısıtlayıcı enzimi olan fosfofrukto kinaz 1 ( FFK 1 ) enzimini inhibe eder, yani glikolizi durdurur. Diğer yandan yağ asidi sentezinde yine hız kısıtlayıcı enzim olan Asetil KoA Karboksilaz’ı ise aktive eder. Yani yağ asidi sentezini aktive eder. TCA’da oluşan Sitrat kendisini oluşturan enzimi de inhibe eder. Yukarıdaki şekilde gösterilmiştir.

Şekil 33 : Fluoroasetat’ın inhibitör etkisi.

TCA siklusunun ikinci basamağında ise sitrat’dan demir-sülfürlü protein olan akonitaz enzimi vasıtasıyla izositrat oluşur. Bu bir izomerizasyon reaksiyonudur. Yukarıdaki şekilde mavi zemin içersinde TCA siklusunun birinci ve ikinci reaksiyonları gösterilmiştir. Yukarıdaki şekilde sarı zeminde ise Fluoro asetat’ın akonitaz enzimini hangi yolla inhibe ettiği gösterilmektedir.

TCA siklusunun üçüncü basamağı ise aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. TCA siklusunun ana amacı enerji elde etmek olduğuna göre, vücutta yeterli enerji bulunmasının veya bulunmamasının bu üçüncü basamağa yaptırımı olan bir etkisi olduğu için, bu basamak TCA siklusunda hız kısıtlayıcı bir basamaktır. Organizmadaki enerji yeterliliğinin en önemli göstergesi ADP varlığıdır.

Şekil 34 : TCA siklusunun üçüncü basamağı.

İzositrat’ın Alfa Ketoglutarat’a dekarboksilasyonunda Mangan ve Magnezyum kofaktör olarak kullanılır, enzim ise İZOSİTRAT DEHİDROGENAZ ( İSD )’dır ve  İSD, en çok akut karaciğer harabiyetlerinde artar, kalpde de vardır fakat enfarktüs marker’ı olarak kullanılmaz çünkü yarılanma ömrü çok kısadır, kanda çok kısa süre kalır ve yıkılır, dolayısıyla güvenilir bir şekilde tesbit edilemez ( NİSAN 1990, 1993 BİYOKİMYA TUS SORULARI ). Üçüncü basamağın önemli olgularından birisi de TCA siklusunda çıkan ilk NADH2 ve ilk CO2’in bu basamakta çıkmasıdır.

Siklusun dördüncü basamağında ise yapısı PDH enzimine benzeyen bir enzim olan alfa ketoglutarat dehidrogenaz enziminin kullanılmasıdır. Bu enzimin de koenzimleri aynı PDH enzimindeki gibidir ( KoA, lipoat, TPP, NAD ve FAD ). Üç ve dördüncü basamaklar ardı ardına NADH2 ve CO2 üretirler. Dördüncü basamakta görev yapan alfa ketoglutarat d. enzimini de enerji fazlalığı inhibe eder, kalsiyum aktive eder. Bir önemli nokta da ürün olarak oluşan Süksinil KoA da bu enzimi inhibe eder.

Karikatür 17 :  TCA’yı kontrol eden enzimler

Buraya kadar anlatılan basamaklar çok önemlidir çünkü TCA siklusunun hızını 3 enzim belirler : Sitrat Sentaz, İzositrat Dehidrogenaz ve Alfa Ketoglutarat Dehidrogenaz ( NİSAN  2012 BİYOKİMYA TUS SORUSU ).

 

Şekil 35 : TCA siklusunun dördüncü basamağı.

Bu üç enzim TCA siklusunun düzenlenmesinde ve hızının kontrolünde başrol oynarlar. Bu 4. Basamakta oluşan süksinil KoA yüksek enerjili bir bileşiktir ve bu enerji tiyoester bağında gizlidir. Bu enerjinin ortaya çıkması için Süksinil KoA’dan KoA’nın ayrılması ve bu kopan bağ enerjisini Guanozin Di Fosfat’a ( GDP ) vermesi gerekmektedir. TCA siklusunda tek GTP sentez edilen basamak bu reaksiyondur. Yani bir yerde substrat düzeyinde fosforilasyon oluşur bu basamakta. GTP enerji değeri olarak ATP ile aynıdır. Sadece GTP’nin ATP’ye çevrilmesi gereklidir.

Şekil 36 : TCA siklusunun beşinci basamağı.

GTP, ATP’ye, ATP de GTP’ye NÜKLEOZİD DİFOSFAT KİNAZ enzimi ile çevrilebilir.  Süksinil KoA döngüde meydana geldiği gibi, propionil KoA ve Malonil KoA’dan da meydana gelebilir. Ayrıca İzolösin, Valin ve methionin gibi bazı amino asitlerin metabolizması sonucu da oluşabilir. Beşinci basamak sonucu oluşan süksinat, altıncı basmak reaksiyonuna girince döngünün tek FADH2’sini oluştururlar. Kullanılan enzim Süksinat dehidrogenaz, oluşan ürün ise fumarat’dır. Süksinat, NADH2 oluşturamaz çünkü indirgeyici gücü zayıftır, NAD+’yi indirgemeye gücü yetmez, ancak FAD+’yi indirgeyebilir. Bilindiği gibi NADH2 2.5 ATP değeri taşırken, FADH2 ise 1.5 ATP değeri taşır. Bu nedenle Süksinat’ın zayıf indirgeme gücünün olması, döngünün tek FADH2’sinin bu basamakta ortaya çıkmasına neden olur.

Fumarat’ın su katılarak parçalanması ise yedinci basamaktaki reaksiyonu oluştururlar ve kullanılan enzim fumaraz, oluşan yeni ürün ise malat’dır. Malat, malat dehidrogenaz enzimi ile okzalao asetat’a çevrilirken son NADH2 de bu reaksiyonda yani sekizinci olan son basamakta meydana gelmektedir. Okzalo asetat ( okzalo asetik asit ) TCA siklusunda bu basamakta oluşabildiği gibi, aspartat amino asidinin transaminasyonu ile de oluşabilir.

Şekil 37 : TCA siklusunun altıncı, yedinci ve sekizinci basamağı.

TCA Siklusunu bu şekilde tamamladıktan sonra şu noktayı da göz ardı etmemek lazım. Bu siklus biribirini oluşturan ardışık moleküller yönünden bakılırsa herhangi bir noktadaki inhibisyon tüm siklusu etkileyebilmektedir. Buna rağmen bu siklustaki bazı anahtar bileşiklere çeşitli amino asitlerden dönüşüm olabilmekte böylece siklus harici başka kaynaklardan da beslenebilmektedirler. Bu konu glukoneogenez konusunda daha detaylı olarak anlatılacaktır.

Şekil 38 : TCA siklusunun kaynağı olan amino asitler ve siklusa girdikleri noktalar.

TCA siklusu önemli bir amaca hizmet etmektedir.Bu amaç oksidatif fosforilasyona ( Solunum Zinciri ) substrat ( H+, elektron ) sağlanmasıdır.TCA siklusunu başlatan olay yani tetik mekanizması : Asetil KoA’nın siklusa dahil olmasıdır ve bu nokta okzaloasetat’ın bulunduğu yerdir ( NİSAN 1991 ve 2002 BİYOKİMYA TUS SORULARI ). Yukarıdaki şekilde görüldüğü üzere tepkimeler sırasıyla : Asetil KoA, Okzaloasetat, Sitrat, İzositrat,Alfa Ketoglutarat,Süksinil KoA, Süksinat, Fumarat ve Malat.

Enerji nerelerden geliyor ?

Sitrik Asit döngüsünde net ATP üretimi 10 ATP’dir. Sitrik Asit döngüsünde her biri yaklaşık 2.5 ATP karşılığı olan NADH2’yi  oluşturan Dehidrogenaz enzimlerinin ( İzositrat Dehidrogenaz, Alfa Ketoglutarat Dehidrogenaz ve Malat dehidrogenaz ) kofaktörü Tiamin ( Vitamin B1 ) ‘dir. Pantotenik asit ise , Asetil KoA ve Süksinil KoA ‘nın yapısında görev alır. Riboflavin ( FAD ) ve Niasin ( NAD, B3 vitamini ) de  TCA siklusunda kullanılırken, TCA’da kullanılmayan tek B vitamini : Piridoksin yani Vitamin B6’dır, Ayrıca Vitamin B12 de Propionil KoA’nın TCA siklusuna girmesine yardımcı olurken, Folik Asit TCA’da hiç kullanılmaz ( EYLÜL 1998 ve NİSAN 2005 BİYOKİMYA TUS SORUSU ).

Şekil 39 : TCA siklusunun Enerji Bilançosu ( 1 mol Asetil KoA girdiğinde ).

TCA siklusunun enerji bilançosu, 1 mol asetil KoA’nın okside olması sonucu her ne kadar 10 ATP eşdeğerinde gösterilse de glikoliz’den 1 mol glukoz’dan geliyorsa 7 ATP değerinde aerobik glikolizden enerji getirir, asetil KoA’ya dönüşümden de 5 ATP eşdeğerinde enerji getirir, TCA’da da 2 mol üzerinden hesaplarsak 20 ATP eşdeğerinde enerji getirir böylece toplamda : 7 + 5 + 20 = 32 ATP eşdeğerinde enerji üretilir.

Tek başına TCA’daki enerji bilançosu ise :TCA siklusunda oluşan bir adet substrat düzeyinde fosforilasyon, yine TCA’daki oluşan NADH2 ve FADH2’lerin oksidatif fosforilasyonu ile birlikte toplamda 10 ATP gücündedir. Eğer TCA’daki moleküller de 2’şer mol ise 20 ATP’dir.

ATP’nin yapısını da bağ yapılarıyla birlikte aşağıdaki şeklin sol üst kısmındaki  gibi gösterebiliriz. ATP yapısındaki bağlar beta N glikozidik bağı, fosfo ester bağı ve fosfo anhidrit bağıdır.

Şekil 40 : Reaksiyonun serbest enerji değişimi.

Reaksiyonlar endergonik olabilir veya tam tersi olarak egzorgonik olabilir. Endergonik reaksiyonun işareti + ( artı )’dır. Yani reaksiyonun oluşabilmesi için dışarıdan enerji takviyesine ihtiyaç vardır. Hatta reaksiyon iki yönlü ise ‘’su geri basar ‘’ yani reaksiyon ters yöne doğru oluşur veya oluşamaz. Egzergonik reaksiyonda ise reaksiyon işareti –  ( eksi ) ‘dir. Yani dışarıdan enerji vermeye gerek yoktur, reaksiyon neredeyse spontan oluşur, reaksiyon adeta akar.

Buna bir örnek verelim. Örneğin ortamda ATP ile glukoz molekülü olsun. Burada spontan olarak glukoz molekülü ATP’den üzerine 1 fosfat molekülünü alır. Yani ATP’den 1 fosfat molekülü kopar ortaya egzergonik bir enerji çıkar. Bilindiği gibi ATP’nin son fosfat bağının enerjisi koparılırsa -7.3 kcal/mol’dür. Daha sonra kopan fosfat glukoz’a eklenmek için dışarıdan enerji kullanır. Bu durumda gereken enerji de + 3.3 kcal/ mol’dür. Reaksiyon bittiğinde elde kalan net enerji baştaki bağın kopma enerjisi ile fosfat’ın transfer edilme enerjisi arasındaki fark kadardır. Bu fark : -7.3 ( + 3.3 ) = -4.0 kcal/mol ‘dür.

Şekil 41: Endergonik ve egzergonik reaksiyona örnek.