İNSÜLİN hakkında tüm detaylar ( daha bitmedi )

İnsülinin yapısı ; katlanabilirlik, akan metabolik trafik, kendi kendine düzenlenme ve reseptöre bağlanma gibi belirleyicileri içerir.
İnsülin, proteolitik işlenmesi tek zincirli bir öncü olan preproinsülinin biyosentetik ürünüdür.
Proinsülinin bağlantı (C-peptit) alanı, esas olarak olgunlaşan salgı granülleri içerisinde etki eden özel bir endoproteaz seti ve bir karboksipeptidaz aktivitesi ile uzaklaştırılır.
İnsülin, glukoz tarafından düzenlenen özel salgı kesecikleri içinde mikrokristalin çinko insülin heksamer dizileri olarak depolanır.
İnsülin sekresyonunun düzenlenmesi, plazma membran depolarizasyonu ve kalsiyum-iyon homeostazisini içeren metabolizma ve elektrofizyolojik olaylarla ilişkilidir.
İnsülin reseptörü ise, hücre dışı bir hormon bağlama alanı ve hücre içi tirozin kinaz alanı içeren bir transmembran proteinidir.
İnsülinin, insülin reseptörüne (bir (αβ)2 dimer) bağlanmasına insülinin hem A hem de B zincirlerindeki yan zincirler aracılık eder.

İnsülin genindeki baskın mutasyonlar, proinsülin varyantlarının toksik yanlış katlanması nedeniyle, belirgin şekilde neonatal başlangıçlı kalıcı diyabet dahil olmak üzere, monogenik diyabet sendromlarına neden olur.

İnsülin insan metabolizmasının düzenlenmesinde merkezi bir rol oynar. Hormon, Langerhans Adacıklarındaki β hücreleri tarafından salgılanan 51 kalıntılı bir anabolik proteindir. Disülfid bağlarıyla birbirine bağlanan iki zincir (A ve B) içeren olgun hormon, proinsülin olarak adlandırılan tek zincirli bir öncünün translasyon sonrası ürünüdür.

İnsülinin üç boyutlu yapısına ilişkin kapsamlı çalışmalar, metabolik bozukluk olan Diabetes Mellitus’un (DM) tedavisi için terapötik analogların geliştirilmesine olanak sağlamıştır. İnsülin geni mutasyonları nadirdir. Mutasyonların en büyük sınıfı, proinsülin katlanmasının bozulmasıyla ilişkilidir; bu da genellikle neonatal dönemde başlayan ilerleyici endoplazmik-retiküler (ER) strese, β hücre ölümüne ve DM’ye yol açar.

İnsülinin temel tamamlayıcı fonksiyonları (a) sistemik dolaşımdan glukoz alımının uyarılması ve (b) hepatik glukoneogenezin baskılanması ve birlikte glukoz homeostazisinin düzenlenmesidir.

DM, insülinin göreceli eksikliğinden veya endojen hormona karşı hassasiyet eksikliğinden kaynaklanan azalmış glukoz toleransı ile karakterizedir. Yetersiz insülin veya azalmış insülin duyarlılığı hiperglisemiye neden olur. Dokuların yüksek ortam glukoz konsantrasyonlarına uzun süre maruz kalması, makro ve mikrovasküler hastalıklar da dahil olmak üzere komplikasyonların gelişmesiyle ilişkilidir. Koroner kalp hastalığı, serebrovasküler hastalık ve  retinopati, nefropati ve nöropati özellikle endişe vericidir.

Von Mering ve Minkowski, 19. yüzyılın sonlarında pankreasın alınmasının köpeklerde DM gelişmesine yol açtığını belirtmişlerdir. Schafer ilk olarak 1916’da “insülin” adını verdiği antidiyabetik hormonun, pankreas adacıklarından salgılandığını öne sürdü. Barron 1920’de, ekzokrin pankreasın tahrip edilmesiyle pankreas kanalının ligasyonunun, ancak 1869’da Langerhans tarafından bu şekilde adlandırılan adacıkların da tahrip edilmesi durumunda DM ile sonuçlandığını kaydetti. 

insülin reseptörü (IR) aktivasyonu,  çoklu reseptör sonrası sinyal yollarını modüle eden bir reseptör tirozin kinaz süper ailesine aittir. Böylece insülin, hücre büyümesi ve farklılaşmasının yanı sıra protein ve yağ sentezi, RNA ve DNA sentezi gibi diğer hücresel süreçleri de düzenler. Ancak diyabetin klinik belirtilerinde birincil öneme sahip olan durum, glukoz alımının düzenlenmesidir.

İNSÜLİN İLE PLAZMA GLUKOZUNUN DÜZENLENMESİ

Spesifik membran taşıyıcıları, insülin stimülasyonuna yanıt olarak, plazma glukoz konsantrasyonlarını azaltmak için glukozun hücrelere hareketini kolaylaştırır. Taşınan glukoz daha sonra metabolik yakıt olarak kullanılır veya glikojen adı verilen karmaşık bir polimerik yapı halinde depolanır.

İki ana glukoz taşıyıcı türü bilinmektedir: Na+’ya bağımlı ve Na+’dan bağımsız.

Yalnızca Na+’dan bağımsız taşıyıcılar , insüline duyarlıdırlar.

Na+’ya bağımlı glukoz taşıyıcı ailesi, çeşitli dokularda, özellikle ince bağırsak epitelinde (SGLT1) ve renal proksimal tübülde (SGLT2) ve ayrıca diğer böbrek tübül hücrelerinde tanımlanmıştır. Bu taşıyıcılar bağırsak ve böbrek hücrelerinin lümenal tarafında bulunur ve glukozun bu hücrelere doğru hareketini Na+’nın hücre içine doğru hareketiyle birleştirerek konsantrasyon gradyanına karşı glukozu absorbe etme görevi görür.

Na + elektrokimyasal gradyanında aşağı doğru hareket ettiğinden, bu enerji glukozun hücrelere birlikte taşınması için kullanılabilir. Dolayısıyla bu taşıyıcı, bir Na+/K+ -ATPase iyon pompası tarafından tutulan hücre dışı ve hücre içi sodyum iyonlarının konsantrasyonlarına bağlıdır.

Birkaç izoformdan oluşan Na+’dan bağımsız glukoz taşıyıcı ailesi, glukozun bir plazma zarı boyunca konsantrasyon gradyanına doğru hareketini kolaylaştırır. Yedi izoform tanımlanmış olmasına rağmen (Glut1-7 olarak adlandırılır),  Glut4 önemlidir çünkü iskelet kası, kalp kası ve yağ dokusu dahil olmak üzere insüline duyarlı dokularda en yüksek konsantrasyonda bulunan taşıyıcıdır. Glut4 ve daha az oranda Glut1, bu hücrelerin glukoz alımını artırmasını sağlar ve böylece dolaşımdaki konsantrasyonları azaltır.

Glukozun, glukoz-6-fosfata hızlı fosforilasyonu ve diğer metabolik ürünlere dönüşümü nedeniyle hücre içi glukoz konsantrasyonu düşük olduğundan, plazma zarındaki aktif taşıyıcıların varlığı, glukozun hücrelere girmesi hareketini kolaylaştırır.

İnsülin, hedef hücrelerin plazma zarındaki taşıyıcıların sayısını artırarak glukoz alımını artırır. Bu ilk olarak adipositlerde ve daha sonra iskelet ve kalp kasında gösterilmiştir. Bu tür hücrelerin insülinle uyarılması, glukoz taşınmasını kolaylaştırmak için taşıyıcıları hücre içi bölümlerden plazma zarına doğru harekete geçirir. Reseptörlerin plazma membranına translokasyonunun, insülin uyarımından sonraki 30 saniye içinde gerçekleştiği gösterilmiştir; Uyaran etkisi azaldıkça, plazma zarı reseptörlerinin sayısındaki azalma, glukoz taşınmasındaki bir düşüşle eşzamanlı olarak azalır. Glut4 yoluyla glukoz taşınması pasif bir süreç olmasına rağmen (yalnızca glukoz gradyanının kimyasal potansiyeli ve taşıyıcıların Vmax’ı ile sınırlıdır), translokasyon ve reseptörlerin ters yeniden içselleştirilmesi enerjiye bağlı süreçlerdir.

İnsülinin IR’e bağlanması ve aktivasyonu üzerine hücre içi depolardan Glut4 translokasyonunun sinyalleme yeteneğinin bozulması, Tip 2 DM’de postprandiyal hiperglisemiye neden olur.

Hayvan çalışmaları aynı zamanda insülin direncinin, kas hücrelerinde glukoz taşıyıcılarının plazma zarına translokasyonunun azalmasıyla ilişkili olduğunu da göstermiştir. Aslında, DM’li hayvan modellerinde azalan insülin seviyelerinin yalnızca taşıyıcı translokasyonunu azaltmakla kalmayıp aynı zamanda kas hücrelerinde Glut4 ekspresyonunu da zayıflattığı gösterilmiştir.

Dolayısıyla, insülinin ; hem glukoz taşıyıcı translokasyonunu arttırmak için kısa vadeli bir sinyal hem de hedef hücrelerde bu tür taşıyıcıların bazal ekspresyon seviyesini korumak için uzun vadeli bir sinyal sağladığı görülmektedir. Akut ve bazal etkilerin kombinasyonu, Tip 1 DM’de (düşük veya kaybolan endojen insülin seviyeleriyle karakterize edilir) veya Tip 2 DM’de (insülin direnciyle karakterize edilir) patolojik olarak yüksek plazma glukoz seviyelerine neden olabilen ortak bir mekanizma sağlar : Transmembran düzenleme ve ekspresyonunun kaybı glukoz taşıyıcıları β hücrelerinin yüzeyinde ifade edilen Glut2, insülin sekresyonunun düzenlenmesine katkıda bulunur. Buna göre, β hücresine özgü bir IR , insülinin muhtemelen β hücresinden kendi salgısını pozitif olarak düzenlediğini gösterdi.

İNSÜLİN BİYOGENEZİ VE SALIMININ MEKANİZMASI

İnsülin keşfedilen ilk peptit hormonudur. Abel, 1926’da insülini kristalleştirmeden ve 1935’te Jensen ve Evans, insülinin gerçekten bir protein olduğunu kanıtlayarak B zincirinin N-terminal fenilalaninini tanımlamadan önce, tüm hormonların küçük moleküller olduğuna inanılıyordu. 1950’lerin ortasında insülinin amino asit dizisinin Sanger tarafından aydınlatılmasıyla (bkz. aşağıdaki şekil), insülinin 30- bir zincire bağlı 21 kalıntılı bir A zincirinden oluşan iki zincirli bir heterodimer olduğu anlaşıldı. B kalıntısı zinciri, sistein kalıntılarından (A7-B7 ve A20-B19) türetilen iki disülfit bağıyla oluşturulur. A zincirinde (A6-A11) zincir içi bir disülfit bağı da mevcuttur.

 

İnsülin molekülünün amino asit bileşimi ve büyüklüğü (yaklaşık 6.000 Dalton), öncü ( PRO ) protein (yaklaşık 9.000 D), C alanı olarak adlandırılan, araya giren bir segment aracılığıyla birleştirilen sürekli tek bir zincirde insülinin hem A hem de B zincirini içerir. C alanının uzunluğu omurgalı türleri arasında farklılık gösterir (tipik olarak 30-35 kalıntı) ve her iki ucunda dibazik kalıntılar (Arg-Arg ve Lys-Arg) bulunur. Proinsülin, olgun hormonu ve serbest bir C-peptidi (dibazik kalıntılardan yoksun olan) serbest bırakmak için bu dibazik bağlantılardan trypsin benzeri bir enzim tarafından bölünür.

Araştırmacılar, insülinin ek ve daha büyük bir öncüsü olan preproinsülin olduğunu keşfetti. Bu tek zincirli polipeptit (yaklaşık 12.000 Dalton), amino terminalinde hidrofobik kalıntılardan oluşan 24 kalıntılı bir sinyal peptidi tarafından uzatılan proinsülin içerir. Böyle bir sinyal dizisi, salgı yoluna giren proteinlerin karakteristiğidir. Preproinsülinin sinyal peptidi, ER’ye translokasyonuyla eşzamanlı olarak bölünür ve dolayısıyla proinsülinin kendisi (ER’nin oksidatif katlama makinesiyle birlikte) uygun disülfit eşleşmesine ve üç boyutlu protein katlanmasına aracılık eder.

İnsan insülin geninin 1500 bazında kodlanan bilgilerin (Bell ve meslektaşları tarafından 1980’de sıralandığı gibi) preproinsüline dönüştürülmesinde ve bunun ardından insüline proteolitik dönüşümünde yer alan adımlar aşağıdaki şekil’de gösterilmektedir. İlk adımlar nükleik asit seviyesinde meydana gelir: ilk mRNA transkripti, araya giren iki dizinin eksizyonu yoluyla değiştirilir, 5′ terminali 7-metil guanozin ile kapatılır ve 3′-terminal, poliadenilasyona uğrayarak bir poliadenilasyona uğrar ( olgun mRNA ürünü ).

Bu mRNA ürünü, kaba endoplazmik retikulum (rER) üzerinde çevrilen ve daha sonra sinyal peptidinin, rER membranındaki sinyal tanıma partikülü (SRP) ve SRP reseptörü ile bir dizi etkileşimi yoluyla RER lümenine translokasyonu yapılan preproinsülini kodlar. Bir sonraki adım dizisi protein düzeyinde gerçekleşir. Sinyal peptidi, rER lümeninde bir sinyal peptidaz (rER membranının lümenal tarafında bulunur) tarafından yarılır. rER’nin sarnıçları içinde proinsülin, insülinin doğrudan öncüsü olan doğal üçüncül yapıyı oluşturmak için hızlı bir şekilde katlanır ve disülfür bağı oluşumuna uğrar. Sinyal peptidi rER’de hızla parçalanır ve bu nedenle β hücrelerinin normal bir salgı ürünü değildir.

Son aşamalarda proinsülin Golgi aygıtına taşınır ve burada salgı granülleri halinde paketlenir ve doğal insülin ve C-peptide dönüştürülür. Dönüşüm süreci trans Golgi ağında başlayabilir ancak yoğunlaşan vakuollerde (erken salgı granülleri) devam eder ve ürünler olgun salgı keseciklerinde depolanır ve küçük miktarlarda (yaklaşık %2-3) birlikte eşmolar miktarlarda salgılanır. proinsülin ve ara bölünme ürünleri. Glukoz, beta hücreleri tarafından insülin salgılanmasını uyarmanın yanı sıra, aynı zamanda insülin gen transkripsiyonunu da aktive eder, insülin mRNA stabilitesini arttırır ve translasyonunu uyarır.

Proinsülin, daha büyük boyutuna rağmen insülinin birçok fiziksel özelliğini paylaşır. Proinsülinin,  insüline benzer bir şekilde dimerler ve Zn2+-koordineli heksamerler oluşturduğu, karşılaştırılabilir bir izoelektrik noktaya ve çözünürlüğe sahip olduğu ve insülin antiserumları ile çapraz reaksiyona girdiği gösterilmiştir.

Proinsülin ( %3-5 biyolojik aktivite gösterir ) ve insülindeki , C alanı esnektir ve birbirlerinin agonistidirler.

Proinsülin veziküllerinin rER’den cis Golgi’ye ve Golgi Apparatus yoluyla taşınması, ATP gerektiren, enerji gerektiren bir süreçtir. Trans Golgi’de başlatılan proinsülin‘in daha sonra insüline dönüşümü, prosekretuar granüller içinde hızlanır, çünkü bunlar asitleşip sitozolde salgılanmaya hazırlanmak için 1-3 saatlik bir süre içinde olgunlaşır. Artık proinsülin ve ara parçalanma ürünleri, toplam depolanmış insülinle ilgili proteinin yalnızca % 2-3’ünü oluşturur. İnsülin salgılayan granüller normalde birkaç saat veya birkaç gün gibi çok daha yavaş bir hızda değişir.

Proinsülinin insüline dönüşümü, iki tip proteazın ortak etkisi yoluyla meydana gelir: biri, C alanının her iki ucundaki dibazik kalıntı çiftlerinden sonra bölünen, trypsin benzeri endoproteaz aktivitesine sahip olandır ve diğeri, karboksipeptidaz B’ninkine benzeyen ekzopeptidaz aktivitesine sahip olan proteazlardır. Bu çalışma in vitro olarak da gerçekleşebilir.

İnsülinoma salgı granüllerinde iki endoproteaz vardır. Başlangıçta Tip I ve Tip II dönüştürücü enzimler olarak adlandırılan bu asidik endoproteazların her birinin Ca2+ iyonlarına bağımlı olduğu bulundu. Proinsülinde Arg31-Arg32’de (C alanının ilk iki konumu) bölünürken Tip II, 0,1 mM Ca2+ gerektirdi ve ağırlıklı olarak Lys64-Arg65’te (C alanının son iki konumu) bölündü. Her birinin ayrıca 6,0’a yakın bir asidik pH optimumuna sahip olduğu bulundu.

Pankreas adacıkları β-hücreleri üzerinde yapılan immünositokimyasal çalışmalarda, β-hücreleri pankreatik adacıklarında hem PC2 hem de PC1/3’ün olduğu ve bunların da proinsülini insüline dönüştürme yeteneklerinin olduğu, bu nedenle PC2 ve PC1/3 eksprese eden aşı virüsleri önemli hale geldi. B hücresinin olgunlaşan salgı granülünde PC2, PC1/3 ve karboksipeptidaz E birlikte çalışarak proinsülini olgun insülin ve C-peptide dönüştürür. Çalışmalar, PC1/3’ün ilk olarak B zinciri-C peptid bağlantısında proinsülini parçaladığını ve insülin vermek üzere tercihen PC2 tarafından parçalanan bir ara ürün ürettiğini göstermiştir. Dolayısıyla PC1/3’ün azalması, dolaşımdaki proinsülin seviyelerinin çok yüksek olmasına neden olur.

β hücresindeki salgı granülleri sitozolde olgunlaşır. Elektron mikroskobik (EM) çalışmalar, olgun granüllerin, 2-Zn insülin kristallerine benzer aralıklı, yoğun kristal görünümlü bir çekirdeğe sahip olduğunu göstermiştir. Yeni sentezlenen insülinin, çinko taşıyıcının (ZnT8) azaltılmasıyla , olgunlaşan salgı granüllerine taşınan çinko iyonları ile kristaller oluşturması muhtemeldir. Kristaller, β-granüllerin yoğun çekirdeğinde bulunurken, çözünür C-peptid, granülün daha az yoğun veya berrak çevresinde bulunur. Proinsülinin, muhtemelen karışık heksamerler halinde, küçük miktarlarda insülin ile kristalleştiği de bilinmektedir. Hem proinsülin hem de insülin, çinkoyu bağlama ve çinko-koordineli heksamerler (heksamerik birim başına iki Zn2+ eksenel atom) oluşturma yeteneğine sahiptir; histidin B10‘un yan zinciri eksenel Zn 2+ iyonlarını koordine eder. Çinko-insülin heksamerlerin kendiliğinden birleşmesi ve mikro kristalleşmesi, pH ile düzenlenebilir. Salgı granülleri, granül içindeki pH’ı pH 5.0-5.5‘e düşürmeye yarayan içsel bir proton pompasına sahiptir: bu, hem prohormon işlenmesi hem de in vitro kristalizasyon için idealdir. rER içindeki pH daha az asidiktir, bu da tiyol-disülfid değişimini ve dolayısıyla doğal disülfid eşleşmesi ile proinsülin katlanmasını destekler.

Adacıklardaki yüksek orandaki glukoz konsantrasyonu, insülin biyosentezini destekler ve sekresyonun birincil düzenleyicisidir. Yüksek glukoz konsantrasyonları, cAMP seviyelerinde bir artışa neden olur. cAMP daha sonra etkilerini protein kinaz A’yı (PKA) içeren bir mekanizma yoluyla uygular ve belirli anahtar proteinlerin fosforilasyonuna ve aktivasyonuna yol açar. Bu karmaşık olaylar zinciri boyunca, glukoz ve cAMP (ve muhtemelen hücre içi serbest kalsiyum ve IP3’teki artışın katkıları), insülin mRNA’sının translasyonunu ve transkripsiyonunu hızla artırır.

İnsülin mRNA’sı normalde yavaş bir şekilde döner ve yarılanma ömrü normalin altında yaklaşık 30 saattir. Ancak ortamdaki yüksek glukoz konsantrasyonları, insülin mRNA’sının yarı ömrünü üç kata kadar artırır. Salgı granüllerinin kalsiyuma bağlı ekzositozu,  glukozla uyarılmıştır.

 rER’den plazma zarına doğrudan proinsülin salgılanması çok az olur veya hiç olmaz. Diğer hormonlar ( glukagon, glukagon benzeri peptid-GLP-1, kolesistokinin, ve gastrik inhibitör peptit ) ve kimyasal maddeler de insülin salgısının düzenlenmesinde önemli bir rol oynarlar.

İnsülin sekresyonunun inhibitörleri arasında beta hücre zarı üzerindeki adrenerjik reseptörlerle etkileşime giren katekolaminler (adrenalin ve noradrenalin) ve pankreas adacıklarının hücreleri tarafından salgılanan somatostatin bulunur. 

Pankreas β hücrelerinde insülin salgısının  düzenlenmesinde, elektrofizyolojik iletim ile, hücre içi Ca2+ düzeyleri, salgı granüllerinin ekzositozuna yol açar.

İNSÜLİN SALGISINININ BİYOKİMYASI VE ELEKTROFİZYOLOJİSİ

β hücrelerinden insülin salgılanmasının, sağlıklı bireylerde glukoz homeostazisinin düzenlenmesinde önemli bir rolü olduğu gibi ; hem Tip 1 hem de Tip 2 DM’de (farklı nedenlerle) bozulduğu da hastalığın patofizyolojisidir. Aslında Tip 1 DM’nin prediyabetik durumunda ve Tip 2 DM’nin çeşitli formlarında insülin sekresyonundaki anormallikler patofizyolojinin ayrılmaz bir bileşenidir.

İnsülin büyük yoğun çekirdek keseciklerinde (LDCV) depolanır ve yukarıda açıklandığı gibi ekzositozla salınır. Bu salınım, salgı keseciklerinin plazma zarına taşınmasını, daha sonra kenetlenmesini, hazırlanmasını ve son olarak keseciğin plazma zarı ile füzyonunu içeren çok adımlı bir işlemdir. Bu süreç, beta hücresinin elektriksel depolarizasyonu ve insülin salınımı ile bağlantılı olarak besinler, diğer hormonlar ve nörotransmiterler tarafından ortaklaşa düzenlenir. Bununla birlikte, maksimum uyarı altında bile β hücresindeki keseciklerde depolanan insülinin yalnızca küçük bir kısmı salınır. Yani, sistemik insülin seviyelerinin biyosentezden ziyade sekresyonla düzenlendiği ve normalde depolama havuzlarının boyutuyla sınırlı olmadığı anlaşılmaktadır. Ancak insülin granüllerinin plazma zarına yönlendirilmiş taşınmasını düzenleyen mekanizmalar da tam olarak anlaşılmamıştır.

 Çok sayıda iyon kanalı, pompa ve taşıyıcı, diğer iyonların yanı sıra hücre içi kalsiyum konsantrasyonuna katkıda bulunarak p hücresinin membran potansiyelini (Vm) ayarlar; hücre dışı glukoz ~3 mM olduğunda bu ayar noktası -70 mV’ye yakındır.

β hücreleri elektriksel olarak uyarılabilir ve glukozun bu uyarılabilirliği kontrol ettiğini biliyoruz. Ayrıca β hücrelerinin aksiyon potansiyellerinin sülfonilüreler tarafından artırılmaktadır.

ATP’ye duyarlı potasyum (KATP) kanallarının dinlenme membran potansiyelindeki anahtar rolü de , β hücresi ve bu kanalların insülin sekresyonu mekanizmasındaki önemi de çalışılmaktadır.

Glukoz konsantrasyonunun >8-10 mM’ye yükselmesi, β hücresinin depolarizasyonuyla sonuçlanır. Glukoz, GLUT2 taşıyıcısı tarafından β hücresine alınır ve ATP üretmek için glukokinaz, glukoliz ve mitokondri yoluyla metabolize edilir. Bu, ATP/ADP oranını değiştirerek KATP kanallarının kapanmasına ve azalan K+ geçirgenliği yoluyla hücrenin depolarizasyonuna neden olur.

ATP, KATP kanallarını engeller ve ADP onları açar. Glukoz metabolizması tarafından üretilen diğer nükleotidler (Ap3A: diadenozin trifosfat ve Ap4A: diadenozin tetrafosfat), KATP kanallarının kapanmasına aracılık eden ikinci haberciler olarak gösterilmiştir, ancak bunların önemi belirsizliğini korumaktadır.  SUR1’deki mutasyonlar kalıcı aktivasyona neden olarak neonatal hiperinsülinemi ve hipoglisemiye yol açabilir.

 Membran depolarizasyonunda voltaja bağlı Ca2+ kanalları (Cav) açılır; ve glukozla düzenlenen salgı granüllerinin ekzositozu olur ve insülin salgılanır.

Cav kanalları, düşük voltaj eşiğine (LV: daha negatif potansiyellerde etkinleştirilir) veya yüksek voltaj eşiğine (HV: nispeten depolarize potansiyellerde etkinleştirilir) göre sınıflandırılır. HV kanalları ayrıca alt sınıflara ayrılabilir: L, N, P, Q ve R. İnsülin sekresyonu, L tipi Cav’yi inhibe eden dihidropiridin bazlı kalsiyum kanal bloke edici ajanlar tarafından inhibe edilir. L tipi Cav aktivatörleri insülin sekresyonunu uyarırlar.

Voltaja duyarlı yolakların yanı sıra çeşitli hormonlar ve nörotransmiterler de insülin sekresyonunu düzenler. Epinefrin, galanin, somatostatin, asetilkolin ve glukagon benzeri peptid (GLP) gibi moleküllerin her biri, aynı kökenli reseptörlere bağlanarak insülin salgısının düzenlenmesine katkıda bulunur.

Kolesistokinin (CCK reseptör yolu) ve asetilkolin (β hücrelerindeki M3 reseptörü), fosfoinositid katabolizması yoluyla insülin sekresyonunu güçlendirir ve ardından hücre içi kalsiyum iyonlarının mobilizasyonu sağlanır.

GLP-1 ve glukoza bağımlı insülinotropik polipeptit (GIP) gibi diğer insülin salgılanmasını güçlendirici maddeler, adenil siklazı aktive etmek ve hücre içi cAMP’yi arttırmak için ilgili aynı kökenli GPCR’lere bağlanır, bu da protein kinaz A’yı (PKA) aktive eder. PKC veya PKA’nın uyarılması, beta hücresindeki ikinci haberci sistemlerini değiştirir ve insülin sekresyonunu etkilemek için iyon kanallarını kimyasal olarak değiştirebilir.

İnsülin salgılanma sürecinin oldukça karmaşık olduğu açıktır; ve araştırmalar β hücresi moleküler biyolojisi ve elektrofizyolojisi hakkında yeni bilgiler sağlamaya devam ediyor. Bu tür çalışmalar insülinin etkisinin ve DM’deki serbestleştirilmesinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

İnsülinin üç boyutlu yapısı kristallerde X-ışını kırınımıyla ve çözeltide NMR spektroskopisiyle çok ayrıntılı olarak incelenmiştir. Bu tür çalışmalar proinsülinin katlanması ve insülinin fonksiyonu hakkında değerli bilgiler sağlamıştır. Daha önce de belirtildiği gibi insülin ilk kez 1926’da eşkenar dörtgen formda kristalleştirildi; ve neredeyse 10 yıl sonra Scott, çinko iyonlarının ve diğer iki değerlikli katyonların kristalizasyondaki önemini açıkladı. 1969’da heksamerik 2-Zn insülinin yapısı (modern terminolojide T6 olarak adlandırılır)   X-ışını yöntemleri kullanılarak belirlendi; bu yapı ve daha sonra atomik çözünürlüğe dönüştürüldü.

Şu anda, heksamerlerin (T6, T3Rf3 ve R6), çinko içermeyen dimerlerin (T2) ve monomerik parçaların üç yapısal ailesini tanımlayan çeşitli kristal formları bulunmaktadır.

T 6 insülin hekzameri (MW ~36000 Da), üç katlı bir simetri ekseni ile ilişkili üç dimerik birim olarak düzenlenmiş altı insülin molekülünden oluşur. Dimerler (MW ~12000), üç katlı dönme eksenine dik olan sözde iki katlı bir simetri eksenine sahiptir. Dimerlerdeki her bir protomer benzer ana zincir yapısına sahip olmasına rağmen, belirli yan zincirlerin düzeni bakımından aynı değildir ve ikili simetriyi bozar. En belirgin fark, Phe B25‘in yan zincirinin bir protomerde hidrofobik çekirdeğe doğru, diğerinde ise dışarıya doğru katlanmış olmasıdır. İki eksenel Zn2+ atomu, heksamerin üç katlı simetri ekseninde bulunur; her biri üç His B10 kalıntısı ve üç su molekülü tarafından oktahedral koordinasyon sergiler.

T6 insülin yapısı insülinin hidrofobik, solvente maruz kalan ve potansiyel bağlanma yüzeylerini tanımlar. Bu karakterizasyon, insülin heksamer, tasarlanmış dimer ve tasarlanmış monomerin NMR bazlı çözelti yapıları tarafından desteklenmiştir. Çinko bağlanmasını ve heksamer oluşumunu önleyen His B10 Asn içeren bir varyant insülindir.

İnsülin öncelikle düşük konsantrasyonlarda (~10-6 M) bir monomer olarak bulunur ve nötr pH’ta daha yüksek konsantrasyonlarda dimerler oluşturur. Yüksek konsantrasyonlarda ve çinko iyonlarının varlığında insülin hekzamerik kompleksler oluşturur. Molekülün plazmadaki dolaşım şekli olan insülin monomerleridir.

İnsülin reseptörüne bağlanan ve onu tetikleyen de insülin monomeridir. Biyolojik açıdan önemli olmasına rağmen (insülin, β-hücresinin salgı granülünde çinkoya bağlı hekzamer öz-birleşimi ve mikro-kristalleşme geçirir), çinko iyonlarının konsantrasyonunun düşük olduğu plazmada, önemli miktarda hekzamer bulunamaz. Çinko düşük ise, insülin hekzameri de düşüktür. Ayrıca, portal dolaşımda çinko içermeyen dimerler mevcut olsa da, sistemik dolaşımda salgılanan insülinin kademeli olarak seyreltilmesi, monomerik moleküllerin baskın olmasına yol açacaktır. NMR çalışmaları, çözeltideki serbest monomerin konformasyonunun T-durum kristalografik protomerinin konformasyonuna benzediğini doğrulamaktadır, ancak esnekliği, reseptör bağlanmasının indüklenen uyumla ilişkili olma olasılığını ortaya çıkarmaktadır.

İnsülindeki Yetişkin başlangıçlı diyabet mellitusun monogenik sendromuyla ilişkili klinik mutasyonlar için İkamelere örnek  Val A3 Leu (Insulin Wakayama), Phe B24 Ser (Insulin Los Angeles) ve Phe B25 Leu’dur (Insulin Chicago ). A3 ve B25 mutasyonları reseptör bağlanmasını belirgin şekilde bozarken, Ser B24 bağlanmayı on kattan daha az bozar.

Bazen yüksek doz insüline maruz kalan hastalar, kanser riskiyle ilişkilendirilebilirler.

İnsülin yapısındaki A-zincirinin N-terminal kalıntıları omurgalı insülinleri arasında korunmuştur ve A zincirinin N-terminusunun N-asetilasyonu reseptör bağlanmasında yaklaşık %30’luk bir azalmaya neden olur ve bu da A1’deki pozitif yüklü serbest amino grubunun önemini gösterir. Gly A1’in silinmesi ayrıca reseptörün doğal hormona bağlanmasında %15’lik bir azalmaya neden olur. Gly A1’in çeşitli L-amino asitlerle değiştirilmesi analogların bağlanma oranının %2-20 oranında azalmasına neden olur.

Ile A2 ve Val A3‘ün hidrofobisitesi, yüksek afiniteli reseptör bağlanması için kesinlikle gereklidir.

 N-terminal B-zincir kalıntıları (Phe B1 -Val B2 -Asn B3 -Gln B4 ) biyolojik aktivitede azalmalarla silinebilir (tavşanlarda kan şekerini düşürmede insülinin %60-70’i). Bu sonuçlar N-terminal dört kalıntının hormon-reseptör kompleksinde sınırlı bir öneme sahip olduğunu düşündürmektedir. Buna karşılık, His B5‘in ardışık olarak çıkarılması sadece %15 aktiviteye sahip bir analog olan des -pentapeptit(B1-B5) insülin ile sonuçlanır. Leu B6’nın daha fazla silinmesi < %1 bağlanma afinitesine sahip bir bileşik ile sonuçlanır. Sistin A7-B7 serbest insülin monomerinin yüzeyinde yer alır ve prensip olarak reseptör bağlanmasına katkıda bulunabilir.

B-Zincir COOH-terminus insülin molekülü için çok önemlidir( B-zinciri C-terminal β-ipliği ). Silinme analizi, C-terminal kalıntıları Tyr B26 , Thr B27 , Pro B28 , Lys B29 ve Thr B30‘un kaldırılabileceğini ortaya koymuştur; ortaya çıkan analog des -pentapeptit (B26-B30)-insülin-amid (yani, bir C-terminal karboksilattan yoksun) tamamen aktiftir.

C-terminal beş kalıntısı yine de dimerizasyon ve hekzamir oluşumu için gereklidir. Phe B25‘in (analog C-terminal amidasyonu ile) çıkarılması, reseptör bağlanmasını bozar ( %6  afiniteler bağlanma).

 Phe B24’ün aromatik halkasının işlevsel önemi verimli reseptör bağlanmasında meydana çıkar.

Phe B25 de reseptöre bağlanmada çok etkilidir.B25 pozisyonunda para -azido-Phe veya para -benzoil-Phe içeren foto-reaktif insülin analogları reseptöre etkili bir şekilde çapraz bağlanır. Bu nedenle ve Phe B25 Leu’nun (İnsülin Chicago) belirgin inaktivitesi vardır.

 

İnsülinin üç boyutlu yapısı

İnsan insülin polipeptitlerinin amino asit dizileri Sanger ( Frederick Sanger 1958 Nobel Kimya Ödülü ) ve arkadaşları tarafından 1950’lerin başında belirlenmiştir . Hormon, olgun formunda iki polipeptit zincirinden oluşur: 30 kalıntılı bir B zinciri ve 21 kalıntılı bir A zinciri, iki disülfür bağıyla (CysB7 ila CysA7 ve CysB19 ila CysA21) birbirine bağlanmıştır ve ayrıca A zincirinde (CysA6 ila CysA11) bulunan bir başka disülfür bağı vardır. İnsülinin olgun formu, B zincirinin C terminalinin, A zincirinin N terminaline sözde “C peptidi” ile bağlandığı tek zincirli bir polipeptit olan “proinsülin” öncüsünden kaynaklanır . Olgunlaşma, C peptidinin enzimatik olarak uzaklaştırılmasını ve ayrıca yeni oluşan B ve C peptid C uçlarının karboksipeptidazlar tarafından kırpılmasını içerir.

İnsülinin üç boyutlu atomik yapısı 1969’da Hodgkin ve arkadaşları tarafından yayınlanmıştır , insülin yapısı belirlenen altıncı proteindir. 2,8 Å çözünürlükte X-ışını kristalografisi ile belirlenen bu yapı, B zincirinin merkezi bir α heliksi (B9 ila B19 kalıntılarını kapsayan) ve A zincirinin iki α heliksi (sırasıyla A1 ila A8 ve A12 ila A20 kalıntılarını kapsayan) içerdiğini ortaya koymuştur.

Yukarıdaki şekilde ( A,B,C,D,E ) ; İnsülinin üç boyutlu yapısı ve tahmini reseptör bağlanma yüzeyleri tasvir edilmiştir. ( A ) Zincir A (camgöbeği) ve B (macenta) ile birlikte iki zincir arası disülfür bağı ve bir zincir içi disülfür bağı gösteren insülin monomerinin yapısı. ( B ) İnsülin dimerinin ve üç dimerin insülin hekzamerine montajı. İki çinko atomu (yeşil) hekzamer ekseninde yer alır. Üç dimer, çeşitli gösterimlerle (sırasıyla şerit, şerit artı şeffaf yüzey ve opak yüzey) gösterilmiştir. ( C ) Seçili kalıntıların vurgulandığı insülin dimer arayüzünün ayrıntısı. ( D ) İnsülinin reseptör bağlanma kalıntılarının sözde “klasik” kümesi (çubuk gösterimi); bunlar insülinin dimer oluşturan yüzeyiyle (saydam beyaz) örtüşür. ( E ) İnsülinin reseptör bağlanma kalıntılarının tahmini ek kümesi (çubuk gösterimi); bunlar insülinin hekzamer oluşturan yüzeyiyle (saydam beyaz) örtüşür.

 

B20 ila B23 kalıntıları bir tip II β dönüşü oluşturur ve B24 ila B30 kalıntıları B zincirinin α heliksine anti-paralel uzanan uzatılmış bir iplik oluşturur. Kristalin içinde, 51 kalıntılı molekül, iki katlı (kristalografik olmayan) bir eksenle ilişkili dimerlere bir araya getirilir ve dimerler daha sonra üç katlı (kristalografik) bir eksenle ilişkili trimerlere dönüşür. Monomerlerin dimerlere bir araya getirilmesi, büyük ölçüde, anti-paralel, iki zincirli bir β tabakası oluşturan ilgili B24-B30 zincirleri tarafından aracılık edilir. İki çinko iyonu, hekzamerin üç katlı simetri ekseninde yer alır ve her iyon, HisB10 kalıntısı tarafından  koordine edilir.

İnsülin Kristalin içindeki hekzamer topluluğunun, nötr pH, çinko iyonlarının varlığı için gereklidir, Çinko iyonlarının kaybında ise hekzamerin parçalanması tetiklenir.

Yapısal bütünlük için korunan kalıntıların insülindeki çarpıcı örnekleri altı disülfür bağı oluşturan sisteindir; bilinen tüm insülinler bu altı kalıntıyı içerir. İnsülinlerde korunan hidrofobik çekirdek LeuB6, LeuB11,LeuB15,LeuA16, GlyB8, GlyB23,  ValB18 ve IleA2 kalıntılarını içerir. Kesinlikle korunan yüzey kalıntıları arasında ValB12 ve PheB24 bulunur; bu kalıntılar hormon dimerizasyonunda rol oynar, bu da dimerizasyonun türler arasında korunan bir özellik olduğunu gösterir.

Yüzey kalıntısı korunumuna dair belirgin istisna, (a) çinko şelatlayıcı kalıntı HisB10‘da (kobaylarda asparagin ve glutamin), (b) kalıntı GlyB20‘de (B-zinciri C-terminal segmentinin B-zinciri heliksine anti-paralel olarak geri katlanmasını sağlayan β dönüşünde rol oynayan bir kalıntı; kobaylarda glutamin ve arginin) ve (c) dimer arayüzü oluşturan kalıntılar PheB25 ve TyrB26‘da (kobaylarda sırasıyla tirozin ve arginin) ikamelere sahip olan histrikomorf insülinlerdir.

İnsülinin – reseptör etkileşiminin, hormonun “klasik” reseptör bağlanma bölgesi olarak adlandırılan bölgeye kalıntılar ( ValB12, TyrB16, GlyB23, PheB24, PheB25, TyrB26, GlyA1, GlnA5, TyrA19 ve AsnA21 ) aracılığıyla bağlanmaktadır.

İnsülinin reseptörüne nasıl bağlanabileceğine dair verilerin yanında, bağlı radyoaktif etiketli insülinin hızlandırılmış ayrışmasının nedeni, bağlanma alanları arasındaki negatif işbirliğinden kaynaklanmaktadır.

İnsülin’in reseptöre katılımının, insülin B zincirinin C-terminal segmentinin hormonun çekirdeğinden ayrılması ile gerçekleşir ( konformasyonel değişime uğrar ). Ancak, mutant kalıntılarda bu olmayabilir ve fonksiyonu da yoktur zaten. İnsülinin üç boyutlu yapısı birçok işlevi yerine getirmesi gerekir: pankreas β hücrelerinde depolanma, plazmada taşınma, reseptöre katılımı ve en sonunda endosom içinde proteolitik bozunma için hazır olma. Hormonun yüzeyinin çoğu bu nedenle muhtemelen birden fazla rolde yer almaktadır .

 İnsülin reseptörünün üç boyutlu yapısı

İnsülinin hücre zarları boyunca glukoz taşınmasını teşvik etmedeki rolü 1949’da keşfedildi.  İnsülin reseptörü ilk olarak 1972’de karaciğer ve yağ hücre zarlarından izole edildi. Reseptörün (N terminalinden itibaren) bir lösin açısından zengin tekrar alanı (L1), bir sistein açısından zengin bölge (CR), bir ikinci lösin açısından zengin bölge (L2) ve üç tahmin edilen fibronektin tip III alanı (sırasıyla FnIII-1, FnIII-2 ve FnIII-3 veya F1, F2 ve F3 olarak gösterilir) içerdiği, ardından bir transmembran (TM) alanı, bir hücre içi juxtamembran segmenti (JM), bir tirozin kinaz (TK) alanı ve bir C-terminal kuyruğu (C-kuyruğu) içerdiği görülür.

 

İnsülin’in reseptörüne  bağlanmasının sonucu olarak : JM segmentinde iki tirozin kalıntısının, TK alanında üç tirozin kalıntısının ve C-kuyruk segmentinde iki tirozin kalıntısının otofosforilasyonları olur.Reseptörün  tirozin kinaz alanının yapısı, protein serin/treonin kinazlarının yapılarına benzerdir.

 

insülinin üç boyutlu yapısı holo-reseptörün yapısını tam olarak yansıtmayabilir. Tip 1 insülin benzeri büyüme faktörü reseptörü (IGF-1R) , insülin reseptörüne amino asit dizisi olarak çok benzer.

Her şeyi bir araya getirelim: İnsülin, reseptörünü nasıl harekete geçiriyor?

 İnsülinin L1+αCT′ tandem elemanı, reseptörün “birincil” bağlanma bölgesini etkileşime sokar. Bu etkileşimin doğası, insülinin, iki alanlı L1-CR reseptör parçasının ekzojen bir αCT′ peptidiyle (sözde insülin “mikro-reseptörü” veya “μIR” ) tamamlandığı insülin reseptörünün alan-en aza indirilmiş bir versiyonuyla ko-kompleks halindeki kristal yapıları (2.9 Å çözünürlüğe kadar) aracılığıyla ortaya çıkarıldı ( PDB 3W11 , PDB 4OGA , PDB 6VEP ).

İnsülin–μIR kompleksi, etkileşime girdiğinde ; insülin B zincirinin C-terminal segmentinin (B24 ila B30 kalıntıları) hormonun çekirdeğinden uzağa doğru katlanır.İnsülin kalıntısı PheB24, B-zinciri C-terminal segmentinin katlanmasında bir menteşe noktası olarak görünür.

αCT′ sarmalı da insülin kenetlenmesi sırasında konformasyonel değişikliklere uğrar: αCT′ sarmalının C-terminal kısmı, reseptör kalıntısı Phe714’ü hormonun çekirdeğiyle etkileşime sokarak daha fazla dönüş içerecek şekilde genişler.

μIR kompleksinin yapısal özelliklerinde ; İlk olarak, insülinin B-zinciri C-terminal segmentinin  katlanması görülür. İkinci olarak, reseptör elemanını etkileyen insülin kalıntıları arasında GlyB8, SerB9, LeuB11, ValB12, GluB13, LeuB15, TyrB16, ArgB22, GlyB23, PheB24, PheB25, TyrB26, GlyA1, IleA2, ValA3, GluA4, AsnA18 ve TyrA19 bulunur. Bu set, hormonun “klasik” bağlanma yüzeyiyle örtüşür. Üçüncüsü, klinik mutasyon veya alanin tarama mutagenezi temelinde insülin’in  bağlanması için önemli olan L1-β ₂ tabakasının yüzeyindeki kalıntılardır.  Benzer şekilde, daha önce insülin bağlanması için önemli olarak tanımlanan αCT′ segmentindeki anahtar kalıntıların (Thr704′, Phe705′, Glu706′, Tyr708′, Leu709′, His710′, Asn711′, Val713′, Phe714′ ve Val715′) bu yapıda insülin, L1-β ₂ tabakası veya her ikisini birden etkilediği görülmektedir. Alanine mutasyona uğradığında insülin bağlanmasını etkilemeyen αCT′ kalıntılarının insülin veya L1-β ₂ yüzeyi ile çok sınırlı etkileşime sahip olduğu görülmektedir (αCT′ kalıntıları Asp707′, Val712′, Pro716′ ve Arg717′). Bu sonuçları yorumlarken, L1-CR modülünün bir αCT′ elemanının yokluğunda insüline bağlanamayacağını belirtmek önemlidir.

İnsülin-bağlı μIR yapısına bitişik alanlar ,  FnIII-1′ ve FnIII-2′ arasında kapsamlı sterik örtüşme meydana gelmesidir. Bu nedenle insülin bağlanması, apo L1+αCT′ elemanının bitişik FnIII′ modülünden önceden ayrılmasını gerektirir.

• (A)

  Tek insülin molekülü, yapı içindeki iki L1+αCT′ elemanından birine ve yukarıda açıklanan μIR tabanlı yapıda görülenle oldukça benzer bir şekilde bağlanır. Özellikle, B-zincir C-terminal segmenti hormonun çekirdeğinden dışarı doğru katlanır, insülin B-zincir heliksi αCT′’ye paralel olarak yanaşır ve αCT′ elemanı L1-β ₂ tabaka yüzeyinde yeniden yapılandırılır ( Şekil 5 A).

• (B)

  Yapı içerisinde, insüline bağlı L1-CR-L2 modülü, apo reseptör ektodomaini içindeki konumuna göre belirgin konformasyonel değişikliklere uğrar. Özellikle, L2 alanı, reseptörün dört alanlı [L2+FnIII-1] ₂ “baş” bileşeninden dışarı doğru katlanır ve L1-CR modülü, FnIII-2′ alanından ayrılır ve daha sonra CR-L2 bağlantısı etrafında daha fazla döner ( Şekil 5 B) – bu değişiklikler, [L1+αCT’]-bağlı insülinin, FnIII-1′ alanının membran-distal halkalarıyla etkileşime girmesini sağlar ( Şekil 5 C). Bu son etkileşimde yer alan insülin kalıntıları arasında AsnB3, HisB5, HisB10 ve GluB13 bulunur, bu dört kalıntı insülin B zincirinin N-terminal kısmında bulunur. Etkileşimde yer alan reseptör kalıntıları arasında Asp 496′, Phe497′, Arg498′ ve Arg539′ ve muhtemelen FnIII-1′ alan kalıntıları 540′-545′ tarafından oluşturulan halka ile birlikte daha fazla kalıntı bulunur (ikinci halka yapı içerisinde düzensizdir).

• (C)

  İnsülin bağlı αCT′ sarmalı, apo formuna göre N-terminal olarak uzanır; αCT′ sarmalı artık reseptör kalıntıları 688 ila 714’ü kapsar, yani sistein üçlüsünün (Cys682, Cys683 ve Cys685) dört kalıntısına kadar uzanır ve bu da α-zincirler arası disülfür bağı(ları) oluşturur ( Şekil 5 D).

• (D)

  Bu konformasyonel değişiklikler ayrıca (i) reseptör alanı L2 ve uzatılmış αCT’ heliksi, (ii) reseptör alanı FnIII-1′ ve uzatılmış αCT’ heliksi ve (iii) reseptör alanları L1 ve L2 arasında kapsamlı etkileşimlere neden olur ( Şekil 5 E). Bu reseptör içi etkileşimler apo ektodomain yapısında yoktur. İlgili kalıntılar arasında αCT′ kalıntıları Lys687′, Asp696′, Glu697′, Ser700′, Phe701′, Lys703′, Glu706′ ve Asp707′, domain L2 kalıntıları Ser323, Val324, Thr325, Gln328, Arg345, Gly346, Leu350 ve Glu353, domain FnIII-2′ kalıntıları Asp496′, Arg498′, Asp499′, Asp533′ ve Thr571′ ve domain L1 kalıntıları Leu87, Phe89, Asn90, Arg114 ve Asp142 yer almaktadır (seçilen kalıntılar PDB değerlendirmesine dayanmaktadır) 6HN5 [ 13 ] ve aşağıda tartışılan diğer insülin kompleksli reseptör yapılarında bildirilenler). Bu sette ilgi çekici olanlar, lösine klinik mutasyonu üzerine şiddetli insülin direncine neden olan Ser323 kalıntısı [ 107 , 108 ] ve alanine klinik mutasyonu üzerine reseptörlerin insüline bağlanamamasına neden olan Asp707’dir [ 109 ]. Uchikawa ve diğerleri [ 14 ], alan L2 kalıntısı Arg345 ile αCT′ kalıntısı Glu697′ arasındaki tuz köprüsünün bozulmasının reseptör aktivasyonunu azalttığını gösterdi.

• (e)

  Reseptör fibronektin-domain modülleri, reseptör ektodomaininin psödo-simetri eksenine doğru içeriye doğru menteşelenir ve FnIII-3 ile FnIII-3′ domainleri arasında bir temas oluşur ( Şekil 5 F).

• (F)

  İnsülinsiz L1′+αCT elemanı, FnIII-2 alanıyla apo benzeri bir ilişki içinde kalır ( Şekil 5 F), ancak αCT heliksi L1′ alanı yüzeyinde zayıf bir şekilde tanımlanmış gibi görünmektedir [ 13 ].

Bu yapının yorumlanmasıyla ilgili olan, kriyoEM örneğinin hazırlanma şeklidir; yani, stokiyometrik insülin fazlalığının uygulanması üzerine bir insülin afinitesi kolonundan elüsyon yoluyla. Fazla insülin daha sonra boyut dışlama kromatografisiyle uzaklaştırıldı ve kompleks daha sonra monoklonal antikor 83-7’nin Fv modülüyle birleştirildi ve boyut dışlama kromatografisiyle yeniden saflaştırıldı, son örnek konsantrasyonu 0,09 mg mL- ¹ oldu [ 110 , 111 ]. 2 Kritik olarak, bu koşullar altında yalnızca tek bir insülin molekülünün tutulması, insülin için iki olası bağlanma bölgesinin (bir durumda L1+αCT′ artı FnIII-1′ ve diğerinde L1′+αCT artı FnIII-1 tarafından oluşturulan) eşdeğer olmadığını ve muhtemelen insülinin holo-reseptöre bağlanmasının bilinen negatif iş birliğini yansıttığını göstermektedir [ 54 ].

Bu yapıdaki FnIII-3 alanlarının etkileşimi de bilgilendiricidir. Bu alanların yan yana gelmesi, fermuar bağlantısının kesin bir kısıtlaması değildir, çünkü FnIII-3 alanının C-terminal çıkışı ile fermuar dizisinin başlangıcı arasında her reseptör β zincirinde yaklaşık 10 kalıntılı bir segment vardır [ 13 , 106 ]. Reseptör bacaklarının yan yana gelmesi, bu nedenle muhtemelen insülin bağlanmasının bir sonucudur ve tirozin kinaz alanlarının ve bunların transfosforilasyonunun yan yana gelmesini sağlayan insülin bağlanması paradigmasıyla uyumludur. FnIII-3 ve FnIII-3′ alanları arasındaki etkileşim kapsamlı değildir, bu da etkileşimlerinin reseptör ektodomaininin sinyalleme-aktif konformasyonunu stabilize etmede önemli bir rol oynamadığını düşündürmektedir [ 13 ]. Bu noktaya daha sonra geri dönülecektir.

Bu yapı tarafından ortaya atılan temel sorunlardan biri, insülinin hekzamerizasyon yüzeyinin reseptörle öngörülen etkileşimini göstermemesidir ( Şekil 1 E), ikinci yüzeyin yüksek afiniteli insülin bağlanması için gerekli olduğu önerilen 1. bölge-2′ çapraz bağının oluşumunda rol oynadığı varsayılmaktadır. Gerçekten de, bu yapıda gözlemlenen insülinin reseptörle olan tek ek etkileşimi, insülinin FnIII-1′ alanıyla olan etkileşimidir ( Şekil 5 C, yukarıdaki (b)’ye bakın); bu etkileşim seyrektir ve hekzamerizasyon yüzeyini içermez [ 13 ], bu da reseptör üzerinde keşfedilecek başka bir bağlanma yüzeyinin daha olduğunu ima eder.

Tartışılacak ikinci kriyoEM yapısı, literatürde lösin-fermuarlı reseptör kompleksinin ortaya çıkmasından kısa bir süre önce Scapin ve arkadaşları tarafından yayınlanmıştır [ 12 ]. Örnek, 10:1 insülin-reseptör oranında insülinle birleştirilmiş izole edilmiş reseptör ektodomenini içermekteydi ve 0,3 mg mL ^-1 konsantrasyonda hazırlanmıştır . Yapı, 4,3 Å çözünürlükte görünüşte simetrik bir şekilde bağlanmış iki insülin göstermektedir ( PDB 6CE9 , PDB 6CEB ). İnsülinler, yukarıda açıklanana benzer bir şekilde ilgili reseptör L1+αCT′ ve L1′+αCT elemanlarına bağlanır, L1+αCT′ ve L1′+αCT modülleri ilgili bitişik alanları FnIII-2′ ve FnIII-2’den ayrılır ve her ikisi de ilgili insülinlerini ilgili alanlar FnIII-1′ ve FnIII-1’in membran-distal halkalarıyla temas ettirmek için benzer konformasyonel değişikliklere uğrar ( Şekil 6 ). Her iki alan L2 ve L2′ reseptör başından dışarı doğru kıvrılır ve αCT′ ve αCT heliksleri N-terminal uzantıya uğrar, bu değişiklikler yine yukarıda açıklanan tek insülin bağlı lösin-fermuarlı reseptör yapısındaki değişikliklere benzerdir. Ancak FnIII-2, FnIII-3, FnIII-2′ ve FnIII-3′ alanları çözümsüzdür ve bu da bunların konformasyonel esnekliğini göstermektedir (ancak FnIII-2′ alanı iki katlı simetri gevşetildiğinde kısmen çözülebilir [ 12 ]). Scapin ve diğerleri ayrıca tek insülin bağlı reseptör ektodomaininin daha düşük çözünürlüklü bir yapısını (7 Å çözünürlük) sundular [ 12 ], FnIII-2, FnIII-3 ve FnIII-3′ alanları da aynı şekilde çözümsüzdür. Bu düşük çözünürlüklü yapının genel konformasyonu, tek insülin bağlı lösin fermuarlı ektodomain için açıklanan yapı ile uyumlu görünmektedir, ancak (insülin içermeyen) L1′-CR′ modülü FnIII-2 alanından ayrılmıştır.

Açıklanacak son kriyoEM yapıları, her biri dört bağlı insülin gösteren iki yapıdır. Bunlardan ilki, 40 μM konsantrasyonda ve 28:1 insülin-reseptör oranında hazırlanan bir insülin reseptörü ektodomeni yapısı kullanılarak elde edildi ve ortalama 4,3 Å çözünürlükte elde edildi ( PDB 6SOF ) [ 15 ] 3. İkincisi, 4:1 insülin-reseptör oranında 7 mg mL-1’de hazırlanan deterjanla çözündürülmüş insülin holo-reseptörü kullanılarak elde edildi ^ve insülin bağlı reseptörün baş kısmı için ortalama 3,1 Å ve yapının tamamı için 3,2 Å çözünürlük sağladı ( PDB 6PXW , PDB 6PXV ) [ 14 ]. TM ve sitoplazmik alanlar, son modelde yoktu. Bu iki yapı ayrıntılarda farklılık gösterse de, insülin bağlanmasının neden olduğu genel konformasyonel değişiklikler iki yapı arasında oldukça benzerdir. Tek insülin molekülleri, L1+αCT′ ve L1′+αCT elemanları tarafından oluşturulan ilgili birincil bağlanma bölgelerine bağlanır. L1-CR-L2 modülleri, Scapin ve diğerlerinin [ 12 ] yapısında görülenlere benzer konformasyonel değişikliklere uğrar ve iki bağlı insülinini sırasıyla FnIII-1′ ve FnIII-1 bölgelerinin membran-distal halkalarıyla temas ettirir, yine yukarıda açıklanana benzer bir şekilde.

Bu iki yapıdaki çarpıcı fark, Scapin ve ark. [ 12 ] ve Weis ve ark. [ 13 ] tarafından daha önce geliştirilen yapılara kıyasla, sırasıyla FnIII-1 ve FnIII-1′ alanlarının dışa bakan β-tabaka yüzeylerine bağlı iki ek insülinin varlığıdır ( Şekil 7 A). Ek insülinler, reseptöre GlnB4, GluB13, LeuB17, ValB18, GluB21, LeuA13, TyrA14 ve GluA17 kalıntıları aracılığıyla bağlanır ( Şekil 7 B). Bu kalıntı seti, reseptör bölgesi 2′ ile etkileşime girmesi öngörülen hekzamer oluşturan insülin kalıntıları setiyle (HisB10, GluB13, LeuB17, SerA12, LeuA13 ve GluA17; Şekil 1 E) yakından uyumludur [ 58 , 112 ]. İki ek insülin, insülinin reseptörsüz konformasyonunu gösterir, yani B-zincir C-terminal segmentleri hormonun çekirdeğiyle etkileşim halinde kalır. Etkileşimde yer alan FnIII-1 alanının kalıntıları arasında Tyr477, Arg479, Lys484, Leu486, Arg488, Pro537, Leu552 ve Arg554 bulunur (FnIII-1′ alanının insüliniyle etkileşimine benzer). Lys484 ve Leu552 kalıntılarının ayrı ayrı alanine mutasyonu daha önce insülin için reseptör IC50’yi sırasıyla iki ve beş kat azalttığı gösterilmişti _[ 112 ] ve Uchikawa ve diğerlerinin çalışmasında [ 14 ], yazarlar Tyr477Ala, Arg479Glu, Lys484Glu, Arg488Glu, Pro536Ala, Pro537Ala, Leu552Ala ve Arg554Glu’nun ayrı ayrı mutasyonlarının her birinin insüline bağımlı aktivasyonu azalttığını ve Lys484 ve Leu552 mutasyonlarının en büyük etkiye sahip olduğunu gösterdi. Ancak, bu [FnIII-1] ve [FnIII-1′] bağlı insülinler 1 veya 1′ bölgelerine monomerler arası çapraz bağlar oluşturmaz (L1 alanları ve ek alanın bir kısmı ile nispeten küçük temaslar dışında [ 15 ]). Bağlanma bölgelerinin, birincil [L1+αCT′] ve [L1′+αCT] bağlanma bölgelerine kıyasla insüline karşı daha düşük afiniteye sahip olduğu varsayılmaktadır; çünkü bu bölgeler yalnızca insülin doyurma koşulları altında oluşmuş gibi görünmektedir.

 

İlginç bir şekilde, dört insülin bağlı yalnızca ektodomain yapısında [ 15 ], FnIII-3 ve FnIII-3′ domainleri birbirleriyle temas halindedir, oysa dört insülin bağlı holo-reseptör yapısında, temas, ilgili α-to-β ve α′-to-β′ disülfür bağlarının hemen aşağı akışındaki α- ve α′-zincir segmentleri arasında oluşurken, FnIII-3 ve FnIII-3′ domainleri arasında hiçbir temas oluşmaz ( Şekil 7 C). Bu monomerler arası temasların her ikisi de yukarıda açıklanan tek insülin bağlı lösin fermuarlı ektodomain yapısındaki temaslardan farklıdır. Bu yapıların zar-yakın elemanları arasında ortak bir etkileşimin olmaması, reseptör ektodomaininin insülin bağlı formunun zar-yakın elemanları arasındaki bir etkileşimle stabilize edilmediğini düşündürmektedir; Bu etkileşimlerin, reseptörün “baş” bölgesinde meydana gelen alan düzenlemelerinin ikincil etkileri olması muhtemeldir.

İki dört insülin bağlı yapı arasında daha fazla fark vardır. Uchikawa ve ark. tarafından sunulan yapı [ 14 ] “neredeyse mükemmel” iki katlı (C2) simetriye sahipti ve dolayısıyla simetri uygulanarak rafine edildi. Sadece baş bölgesinin odaklanmış rafine edilmesi, 3,1 Å çözünürlüğünde daha fazla iyileştirmeye izin verdi. Bununla birlikte, C2 simetrisinin gevşetilmesi, muhtemelen yalnızca üç bağlı insüline sahip olan bir parçacık alt kümesinin tespit edilmesine izin verdi, biri [L1+αCT′] ve [L1′+αCT]’ye ve biri de etki alanı FnIII-1 bölgelerinden birine. Buna karşılık, Gutmann ve ark. tarafından sunulan yapı [ 15 ] yalnızca psödo-iki katlı simetri gösterdi. Özellikle, 2′ bölgesine (yani FnIII-1′ alanındaki bölgeye) bağlı insülinin, Gln672-Ser673 segmentiyle (FnIII-1′ alanına alternatif monomerin ek alanındaki) ve Glu676′-Cys682′ segmentiyle (FnIII-1′ alanına katkıda bulunan aynı monomerin ek alanındaki) etkileşime girdiği görüldü; buna karşın 2′ bölgesine bağlı insülin, her iki monomerin ek alanındaki etkileşime girmedi. Bu insülinler ayrıca ilgili L1 ve L1′ bölgeleri ile etkileşimlerinin derecesi bakımından da farklılık gösterdi. Bu asimetrilerin nedenleri belirsizdi. Ancak, 2,2′ bölgesine bağlı insülinlerin ek alanlarla ve L1 ve L1′ bölgeleriyle etkileşimlerinin seyrek olduğu ve holo-reseptör bağlamında fizyolojik açıdan önemsiz olabileceği belirtilmelidir. Gutmann ve ark. ayrıca, görünüşe göre iki veya üç insülin bağlı partikülden kaynaklanan, başın belirgin asimetrisini gösteren partikül alt kümelerini de tespit etti. Dört insülin bağlı partiküllerinin moleküler dinamik analizi ayrıca, iki site 1 bağlı insülininden birinin diğerinden daha hareketli olduğunu gösterdi. Bu asimetrilerin bağlanma inceliklerini yansıtması mümkün olsa da, partiküllerin hava-su arayüzüyle asimetrik ilişkisinden kaynaklanan asimetrileri yansıtmaları da mümkündür.

Ek insülin bağlama bölgelerinin rolü iyi anlaşılmamıştır. Bunların insülinin reseptörüyle ilk etkileşiminde yer alması mümkündür (insülin kalıntıları LeuA13 ve GluA17’nin alanine bireysel mutasyonu, reseptörün açık oranını yaklaşık 20 kat azaltır [ 113 ]). Ayrıca insülinin bu bölgelere bağlanmasının, apo L1+αCT′ tandem elemanı ile bitişik alan FnIII-2′ arasındaki etkileşimi dolaylı olarak dengesizleştirmesi de mümkündür; bu dengesizleştirme, alan L1’in alan FnIII-2′’den ayrılmasına izin verebilir ve bu da L1+αCT′ elemanının gelen bir insülin molekülü tarafından erişilebilir hale gelmesiyle sonuçlanır. Bu tür dengesizleştirme mekanizmalarından biri, apo-reseptöre bağlanma sırasında bu insülinlerden biri ile alan L2 arasındaki etkileşimler olabilir: insüline bağlı alan FnIII-1’in apo-reseptördeki karşılığı üzerine bindirilmesi, alan L2’nin bir N-terminal halka segmentiyle sterik örtüşmeye neden olur [ 14 ]. Alan L2’nin dengesizleştirilmesi muhtemelen [L1-CR]+αCT’ modülünün alan FnIII-2′ ile etkileşimini dengesizleştirecek ve modülü insülin için erişilebilir hale getirecektir. Alternatif olarak, alan FnIII-1’e bağlı insülin molekülünün kendisinin bitişik insülinsiz L1+αCT’ elemanı tarafından “yakalanması”, ikincisine indüklenmiş bir uyum mekanizmasıyla bağlanması ve bu süreçte alan L1’i bitişik alan FnIII-2’den serbest bırakması mümkündür. Bu ek insülin bağlama bölgelerinin varlığı ve konumu, insülinin L1+αCT’ elemanına nasıl eriştiğine dair bir ipucu sağlayabilir. Bir diğer nokta ise, ek insülinler tarafından bağlanan reseptör bölgelerinin kinetik modelde gerçekten 2 ve 2′ bölgeleri olması durumunda, [L1+αCT’]-bağlı insülinin FnIII-1′ bölgesiyle etkileşiminin 2′ bölgesi olarak atanması ([ 12 ]’deki gibi) yanlıştır.

Belirtildiği gibi, yukarıda açıklanan insüline bağlı insülin reseptörünün kriyoEM yapıları farklı hormon-reseptör stükiyometrisi gösterir: (αβ) _{2 reseptörü başına bir, iki ve dört insülin. Gutmann ve ark. tarafından yakın zamanda yapılan bir çalışmayı [} 11 ] değerlendirmek öğretici olacaktır ; burada yazarlar, insülinin ayrı konsantrasyonlarda (sırasıyla 0 nM, 0,8 nM, 12 nM ve 1000 nm) eklendiği, lipidik bir nanodisk içine yerleştirilmiş insülin kompleksli holo-reseptörün düşük çözünürlüklü negatif lekeli elektron mikroskobu çalışmasını bildirmişlerdir. Bu deneysel koşullar altında, üç boyutlu yeniden yapılandırma engellendi, ancak görüntü analizi, yukarıda açıklanan yapılarla genel olarak uyuşan bir dizi iki boyutlu sınıf ortalaması üretti ( Şekil 8 ). Özellikle, apo ektodomainin Λ şeklinde bir konformasyonu gözlemlendi. İnsülin eklenmesi daha sonra, Λ şeklindeki yapının bacaklarının tek bir sapa dönüştüğü T şeklindeki yapıların kademeli olarak ortaya çıkmasıyla sonuçlandı, ancak düşük çözünürlük bireysel insülin moleküllerinin tespitini engelledi. Dahası, tek bir insülin molekülünün T şeklindeki yapıya geçişi sağlamak için yeterli olduğu görüldü; bu, reseptörün tek bir insülin molekülü tarafından aktive edilebileceğini gösteren verilerle uyumluydu [ 114 , 115 ]. Weis ve ark. tarafından bildirilen yapının şeklini yansıtan sınıf ortalamalarının yetersizliği ( Şekil 5 ; [ 13 ]), insülin içermeyen [L1-CR]′ modülünün bu yapı içindeki bitişik alan FnIII-2 ile ilişkisinin zayıf olabileceğini ve negatif boyama deney koşulları altında ayrılmalarına yol açmış olabileceğini düşündürmektedir. Bu zayıf bağlanma, Scapin ve ark. tarafından bildirilen tek insülin bağlı reseptör ektodomaininin düşük çözünürlüklü yapısını da açıklayabilir [ 12 ]. T şeklindeki yapıların tam iki katlı simetri göstermediği görülmektedir; bu durum insülin kompleksli reseptör “başı” bölgesinin “sap”a göre biraz hareketli olabileceğini veya insülinle veya değişen sayıda insülinle asimetrik olarak kompleks oluşturabileceğini düşündürmektedir.

5. İnsülinin reseptörüyle etkileşiminin kinetiğine ilişkin alternatif bir model

İnsülinin yapısı ilk kez çözüldükten yaklaşık kırk beş yıl sonra, insülinin reseptörüne nasıl bağlandığı yalnızca kısmen biliniyor ve ilerleme, yoğun glikozile disülfür bağlı (αβ) ₂ dimeri olan insülin reseptörünün biyokimyasal ve yapısal karmaşıklığı nedeniyle yavaşlıyor.

İnsülin reseptörünün biyosentezinde her pro-reseptör monomeri proteolitik olarak tek bir disülfür bağıyla bağlı bir N-terminal α-zinciri ve C-terminal β-zincirine ayrılır. (αβ) ₂ dimerinin hücre dışı kısmı her bir transmembran β-zinciri parçası olarak her iki α-zinciri içerir. Her reseptör monomeri birkaç yapısal alandan oluşur: N-terminustan, lösin açısından zengin bir tekrar alanı L1 (kalıntılar 1-157), sistein açısından zengin bir bölge (CR, kalıntılar 158-310), ikinci bir lösin açısından zengin tekrar alanı L2 (kalıntılar 311-470) ve üç fibronektin tip-III alanı: FnIII‑1 (kalıntılar 471-595), FnIII‑2 (kalıntılar 596-808) ve FnIII‑3 (kalıntılar 809-906). FnIII‑2, α / β ayırma bölgesini içeren ~120 kalıntılık bir ek alan (ID, kalıntılar 638-756) içerir. FnIII‑3 alanının C‑terminalinde tek bir transmembran α-heliks, ardından ~40 kalıntılı bir hücre içi juxtamembran bölgesi (JM), bir tirozin kinaz (TK) katalitik alanı ve ~100 kalıntılı bir C‑kuyruğu bulunur.

C. Ward ve meslektaşları tarafından serbest ektodomainin kristalografik çalışmaları, ekstraselüler domainin ters “V” şeklinde birleştiğini; her protomerde L1-CR-L2 domainlerinin bir bacağı ve üç FnIII domaininin diğerini oluşturduğunu göstermiştir (Şekil 9). Bir protomer, dimerde ters “V” ekseni etrafında iki kat dönüşle diğerine bağlıdır ve bunun sonucunda bir monomerin L1-CR-L2 bacağı diğerinin üç FnIII domainine doğru paketlenir. Yukarıda tartışıldığı gibi, mevcut modeller hormon bağlanmasının Site 1 ve Site 2 olarak adlandırılan iki bitişik yapısal eleman tarafından aracılık edildiğini öngörmektedir. Her iki site de yüksek afiniteli hormon bağlanması ve negatif iş birliği için gereklidir.

 

Aşağıdaki şekilde :  İnsülin reseptörünün serbest ektodomaininin yapısı. Orijinal yapı Ward ve meslektaşları tarafından belirlendi ve Lawrence ve meslektaşları tarafından α CT elemanını (kesikli ovallerin içinde macenta) içerecek şekilde rafine edildi. İntakt a alt birimlerinin ve kesik β alt birimlerinin disülfür bağlı dimeri (( αβ ) 2 ), F ab immünoglobulin parçaları tarafından stabilize edildi . Dimerik yapı ters V konformasyonu benimser. Kısaltmalar: α CT, α alt biriminin C-terminal α -heliks elemanı; CR, sistein açısından zengin alan; FnIII-1,2 ve 3, fibronektin homoloji alanları 1, 2 ve 3; ID α, α alt birimi içindeki ek alanın kısmı; ve L1 ve L2, büyük alanlar 1 ve 2. Şeklin hazırlanması için MC Lawrence’a teşekkür ederiz (Ref’e ait web tabanlı Ek’ten izin alınarak yeniden basılmıştır).

Birlikte ele alındığında, insüline bağlı reseptör ektodomeni ve insüline bağlı holo-reseptörün kriyoEM çalışmaları, çoğunlukla birleşik bir şekilde yorumlanabilen bir yapı kümesi sağlar. Ancak, bu yapıları doğrudan De Meyts [ 57 ] ve Schäffer [ 56 ] tarafından önerilen insülin bağlanmasının kinetik modelleri içindeki durumlara eşlemek mümkün değildir. Özellikle,

• (A)

  Hiçbir insülin molekülünün, insülinin klasik bağlanma yüzeyi aracılığıyla bir reseptör monomeriyle ve hekzamer oluşturan yüzeyi aracılığıyla diğer reseptör monomeriyle etkileşime girdiği bir monomerler arası çapraz bağ oluşturduğu görülmemiştir.

• (B)

  Bunun yerine, insülinin klasik bağlanma yüzeyinin, izole edilmiş ektodomain bağlamında bile, monomerleri çapraz bağladığı görülmektedir (yani, tek bir insülin, bir monomerin L1 alanını diğerinin αCT′ segmentine çapraz bağlar). Bu çapraz bağ, afinitesi nM olduğundan, kendi başına yüksek afiniteli (alt-nM) bağlanmayı yansıtamaz [ 104 , 105 ].

• (C)

  İnsülinin ek bir reseptör bağlanma yüzeyi, AsnB3, HisB5, HisB10 ve GluB13 kalıntılarını kaplayan ve FnIII-1′ alanının membrandan uzak halkalarıyla etkileşime giren bir yüzey olarak tespit edilmiştir. Bu reseptör bağlanma kalıntıları büyük ölçüde insülinin hem dimerizasyon hem de hekzamerizasyon yüzeyinin dışında yer alır. Ancak, reseptörle etkileşimleri kapsamlı değildir ve bunları L1+αCT’ elemanına bağlananlarla birlikte gruplandırmak mantıklıdır. Bu insülin etkileşimi hem holo-reseptör hem de yalnızca ektodomain yapılarında mevcut olduğundan, kendi başına yüksek afiniteli bağlanmadan sorumlu görünmemektedir. Bu nedenle yüksek afiniteli bağlanma, reseptör alanlarının kapsamlı yeniden düzenlenmesinden kaynaklanan ek entalpik katkılardan kaynaklanmalıdır.

• (D)

  Bununla birlikte, iki ilave insülinin bağladığı reseptör bölgeleri çapraz bağlama modeli içindeki bölgelere karşılık gelmese de, yüksek konsantrasyonlarda çoğalan bölgelere karşılık gelir ve dolayısıyla yüksek insülin konsantrasyonlarında negatif kooperatifliğin azalmasından sorumlu olabilirler.

Negatif kooperatifliğin kaynağına dair bazı ipuçları ortaya çıkıyor (yani, [L1+αCT′] ve [L1′+αCT] insülin bağlanma bölgelerinin eşdeğer olmaması). Weis ve diğerleri [ 13 ], negatif kooperatifliğin, Cys682, Cys683 ve/veya Cys685 kalıntılarındaki akış yukarısı disülfür bağı(ları) yoluyla αCT′ ve αCT elemanlarının birleşmesinden kaynaklanabileceğini göstererek, αCT′ ve αCT elemanlarının her ikisinin de aynı anda ilgili [L1+αCT′] tandem elemanlarına yüksek afiniteli bağlanma ile uyumlu konfigürasyonları benimseyemeyeceğini ileri sürmüşlerdir.

Bu nedenle, insülin reseptör etkileşimi için burada revize edilmiş bir model önerilmektedir. Apo durumunda, reseptör ektodomeni hem kristal yapısında [ 8 , 94 , 95 ] hem de nanodisk gömülü apo holo-reseptörünün negatif leke görüntülemesinde [ 11 ] görülen Λ şeklini benimser. Bu durumda, birincil insülin bağlanma yerleri, alan L1’in alan FnIII-2’yi ve alan L1’in alan FnIII-2’yi etkilemesi sonucu kısmen tıkanmıştır. 4 Daha sonra, insülinin hekzamer oluşturan yüzeyi, alan FnIII-1’in dışa bakan β-tabaka yüzeyi aracılığıyla etkileşime girmesi nedeniyle reseptör aktivasyonu başlatılır, bu etkileşim düşük afiniteye sahiptir. Böyle bir insülin bağlanması daha sonra alan L1’i alan FnIII-2’den serbest bırakarak L1+αCT’ elemanının daha yüksek (nM) afiniteye sahip bir insülin molekülüne bağlanmasını sağlar. L1 alanının FnIII-1′ alanından ayrılması, büyük olasılıkla FnIII-1′ alanına bağlı insülinin L2 alanıyla etkileşimi tarafından kolaylaştırılır [ 14 ]. L1+αCT’ye bağlanan insülin molekülünün FnIII-1’e bağlı olanla aynı olup olmadığı açık bir sorudur; eğer öyleyse, o insülinin FnIII-1′ alanıyla ilk etkileşimi yoluyla L1+αCT’ elemanına bağlanması, indüklenmiş bir uyum sürecidir. 5 Daha sonra [L1-CR]+αCT’ modülü, bağlı insülinini reseptörün “başına” taşımak için konformasyonel değişikliklere uğrar ve insülin, FnIII-1′ alanının membrandan uzak halkalarına kenetlenir. Bu süreçte reseptör alanlarının önemli ölçüde yeniden düzenlenmesi meydana gelir ve bu da reseptör ektodomaininin membrana yakın bölgelerinin bir araya getirilmesini sağlar. Bu konformasyonel değişiklikler ayrıca insülinin alternatif [L1-CR]′+αCT modülüne olan afinitesini değiştirir, ya FnIII-2 alanına bağlanmasını dengesizleştirerek artırır ya da L1′-β ₂ tabakasının yüzeyindeki αCT elemanının dengesizleşmesiyle azaltır. İkinci bir insülin molekülünün bu bölgeye bağlanıp bağlanamayacağı lokal insülin konsantrasyonunun bir fonksiyonu olacaktır, ancak insüline bağlanmak için serbest olsaydı, insüline olan afinitesi yalnızca (düşük afiniteli) 2 ve 2′ bölgeleri insüline bağlanmak için serbest olan çevredeki reseptörlerin afinitesinden daha fazla olurdu.

Bu süreçler, insülinin 1. bölgeye erişmesine izin vermek için L1 alanının FnIII-2′ alanından geçici olarak ayrılmasını engellemez. Yukarıda belirtildiği gibi, bu tür reseptör alanı hareketliliği, reseptörün bazal aktivitesinin (yani insülin yokluğunda) altında yatıyor olabilir, belki de Kiselyov ve arkadaşları tarafından önerilene benzer bir şekilde (yani, “harmonik salınım”) [ 117 ]. Bu bağlamda, apo insülin reseptörü ektodomaininin kriyoEM yeniden yapılandırma girişimlerinin, yüksek çözünürlüklü yeniden yapılandırmayı engelleyen önemli bir konformasyon heterojenliği gösterdiğini belirtmekte fayda vardır [ 12 , 15 ].

Birkaç alternatif şema önerilmiştir. Scapin ve arkadaşları [ 12 ], αCT segmentinin insülin bağlanmasından önce L1 alanından ayrıldığını ve L1-CR-L2 modüllerinin insülin bağlanmasından önce FnIII modülleriyle etkileşime girmediğini, yani apo reseptörünün kristal yapısında bulunan Λ şeklindeki konformasyona sahip olmadığını, bunun yerine insülin bağlanmasından önce T şeklindeki bir konformasyona sahip olduğunu öne sürmüştür. Ancak, Λ şeklindeki konformasyonun nanodisklerdeki apo holo-reseptör görüntüleri ile doğrulanması göz önüne alındığında, bu çok olası görünmemektedir [ 11 ]. Λ şeklindeki konformasyon, ligand yokluğunda IGF-1R’nin homolog ektodomaini tarafından benimsenen konformasyonla da tutarlıdır ve burada αCT segmentleri de ilgili L1 alanlarına yerleştirilmiş olarak görülmektedir [ 98 ]. Uchikawa ve arkadaşları, bir insülinin önce 1. bölgeye bağlandığını öne sürmüşlerdir [ 14 ], ancak bunun nasıl gerçekleştiğini belirtmemişlerdir. İkinci bir insülinin 2. bölgeye bağlandığını ve insülinin 1′ bölgesiyle etkileşime girmesini ve T şeklindeki yapıya geçişini sağladığını ileri sürdüler. Bu modelde, reseptör tek bir insülinle bağlandığında yalnızca kısmen aktiftir, ancak üç (veya dört) insülinle bağlandığında tamamen aktiftir. Çoklu bağlı insülinlere sahip insülin reseptörlerinin fizyolojik koşullar altında meydana gelip gelmediği açık bir soru olarak kalmaktadır.

6. Son adım: Reseptör aktivasyonu

Yukarıda tartışılan yapılar, insülinin reseptörünü reseptör içi transfosforilasyon yoluyla aktive ettiği paradigmayla uyumludur: Λ şeklindeki apo reseptöründe, TK alanları ayrı tutulurken, insüline bağlı reseptörde, bu alanlar bir araya getirilir. Bu olaylarla ilgili iki ek yapısal çalışma vardır. Birincisi, deterjanla çözündürülmüş insüline bağlı holo-reseptörün kriyoEM çalışmasında birlikte elde edilen çalışmadır [ 14 ]. Bu çalışmada, reseptörün iki TM alanı arasında geçici bir etkileşim gösteren 6,7 Å’de üç boyutlu bir yeniden yapılandırma da elde edildi ( Şekil 9 A). Böyle bir etkileşim, insüline bağlı holo-reseptörün stabilize edilmesine yardımcı olabilir ve bu da hücre içi TK alanlarının transfosforilasyonuna yardımcı olabilir [ 14 ]. Bununla birlikte, düşük çözünürlüklü haritanın TM alanlarının kendilerinin doğru bir şekilde modellenmesini engellediği, ancak ikincisinin bir çözelti yapısının izole olarak belirlenmiş (ve sarmal olduğu gösterilmiş [ 118 ]; Şekil 9 B) olduğu belirtilmelidir. İkincisi, reseptörün tirozin kinaz alanlarının kristal yapısı, juxtamembran bölgesinin kalıntılarını içerecek şekilde N terminaline kadar uzatılmış ve AMPPCP ve Mg ²⁺ ile ko-kompleks halindedir ; juxtamembran kalıntısı Tyr972 ve TK aktivasyon halkası kalıntıları Tyr1158, Tyr1162 ve Tyr1163, kristalleşmeden önce fosforile edilmiştir [ 119 ]. Bu yapı içinde, juxtamembran bölgesinin C-terminal segmenti, TK alanları boyunca trans olarak ilişki kurarak N-terminal lobunun düzenleyici αC heliksini stabilize eder; aktivasyon halkaları katlanmış aktif bir konformasyona sahiptir ( Şekil 9 C). Bu tür trans etkileşimi muhtemelen TK alanlarının aktive olmuş konformasyonunu stabilize eder ve onun alt akış substratlarına ilişkin kinaz aktivitesini destekler.

7. Sonuç

İnsülinden ilk kırınım desenleri 1935 yılında Dorothy Hodgkin (kızlık soyadı Crowfoot) tarafından elde edildi [ 3 ]; insülinin atomik yapısının ortaya çıkması 34 yıl sürdü [ 6 ] ve insüline bağlı reseptörün atomik yapılarının ortaya çıkması 44 yıl daha sürdü [ 9 ]. Bu yapılar onlarca yıllık ilgili biyokimyasal araştırmayı aydınlatırken aynı zamanda yalnızca kısmen anlaşılmış bir moleküler karmaşıklık sergiliyor. Zorluk, mevcut yapısal biyoloji tekniklerinin yalnızca statik görüntüler sağlaması ve sonuç olarak insülin-reseptör etkileşiminin dinamikleri hakkında çok az şey anlaşılmasıdır. İleriye doğru iki yol ortaya çıkıyor. Birincisi, insülinin reseptörü aktive ederken geçtiği konformasyonel yörüngeyi dolduran bir yapı kümesi oluşturmayı amaçlayarak statik görüntü sayısını artırmaktır. CryoEM, tek bir numune içindeki parçacıkların alt popülasyonlarını (üç boyutlu “sınıflar”) ayırt etme yeteneği göz önüne alındığında bu görev için idealdir. Daha iyi örnek hazırlama teknikleri, bu sürece ve stabil ara maddelerin yakalanmasına yol açabilecek mutant insülinlerin veya reseptör yapıların akıllıca kullanımına yardımcı olacaktır. İkincisi, silico simülasyon yoluyladır. Moleküler dinamik simülasyonu, kriyoEM’den türetilen insülin kompleksli insülin reseptörü modellerinin atomik ayrıntılarını iyileştirmek veya doğrulamak ve bu kompleksler içindeki alanların hareketlilik derecesini anlamak için kullanılmıştır [ 15 ]. Ayrıca, yeni insülinlerin yukarıda açıklanan reseptör bölgeleriyle etkileşimini araştırmak için de kullanılmıştır [ 120 ]. Ligand bağlanması üzerine reseptörün tamamında meydana gelen büyük ölçekli alan hareketinin yörüngelerini modellemek için hesaplamalı teknikler de ulaşılabilir hale gelebilir [ [121] , [122] , [123] ]. Bir sonraki adımın on yıllar değil, yıllar içinde gerçekleşmesi muhtemeldir.

Dipnotlar

¹

Kristalize edilen insülin domuz kökenlidir; domuz insülininin insan insülininden farkı, B30 pozisyonunda insan treonininin yerine alanin bulunmasıdır.

²

Fv 83-7 modülünün [ 16 , 111 ] eklenmesi başlangıçta kompleksin kristalografik çalışmasına yardımcı olmak için tasarlanmıştı; kriyoEM deneyinde; burada, potansiyel olarak parçacık sınıflandırmasına ve üç boyutlu rafine etmeye yardımcı oldu. Fv modülü, insülin bağlama bölgesinin distalinde, reseptörün CR alanına eklenir.

³

Hakem değerlendirmesinden önce https://www.biorxiv.org/content/10.1101/679233v1 adresinde yayınlanmıştır .

⁴

Bu monomerler arası etkileşimlerin (alan L1 ile alan FnIII-2′ arasında ve alan L1′ ile alan FnIII-2 arasında) IGF-1R’de reseptörün kendi kendini engellemesi için gerekli olduğu gösterilmiştir: L1 ve L1′ alanlarından yoksun bir IGF-1R yapısı sürekli olarak aktiftir [ 116 ].

⁵

İndüklenen uyum mekanizmasının dolaylı kanıtı, insülin benzeri büyüme faktörü I’in (IGF-I) IGF-1R’nin apo ektodomaininin kristallerine batırılmasından kaynaklanmaktadır. Bu çalışmada, IGF-I’in kafes yerleştirme kısıtlamalarına rağmen IGF-1R’nin tıkalı L1+αCT′ elemanını etkilediği görülmüştür [ 98 ].

Çıkar çatışması

MCL’nin laboratuvarı, Eli Lilly and Company (ABD) ile fonlanmış bir anlaşmaya ve Sanofi-Aventis (Almanya) ile geçmişte işbirliklerine sahiptir. MCL, Monolog LLC’ye lisanslı insülinle ilgili bir patentin ortak mucidi konumundadır.

Referanslar

• 1.Abel JJ Kristalin insülin. Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilimler Akademisi Bildirileri. 1926;12(2):132–136. doi: 10.1073/pnas.12.2.132. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]

• 2. Mol Metab. 2021 Mayıs 13;52:101255.İnsülin ve reseptörünü üç boyutlu yapılarından anlamak

  Michael C Lawrence

  3. Insulin Biosynthesis, Secretion, Structure, and Structure-Activity Relationships
  Michael Weiss, Donald F Steiner, M.D., and Louis H Philipson, M.D., Ph.D.Endotext [Internet].National Library of Medicine
  8600 Rockville Pike Bethesda, MD 20894