by İdrar’da Bilirubinüri tesbiti :
Şekil 1 : Eritrosit mezarlığı dalak’ta Unkonjuge Bilirubin oluşumu.
Yaşam süreleri sona gelmiş eritrositler retikuloendotelyal sistemde dalak mikrozomlarında makrofajlar tarafından parçalanırlar, HEME ve globin parçalarına ayrılır, HEME halkası açılır, demirini kaybeder, önce biliverdin oluşur sonra bilirubin oluşur. Heme’nin dolayısıyla da Bilirubin’in % 90 orijini, Hemoglobin yıkımı ile olur, yukarıdaki şekilde de görüldüğü üzere Bilirubin sentezinde öncül madde BİLİVERDİN’dir ( EYLÜL 1996, 2009 ve NİSAN 2008 BİYOKİMYA TUS SORULARI ).Heme Yıkımı esnasında ayrılan demir tekrar vücut kullanımına girer. Bu yıkılma olayı, mikrozomal HEME OKSİJENAZ enzim kompleksi tarafından yönetilir ve Demir bu molekülden ayrılır ( NİSAN 2003 BİYOKİMYA TUS SORUSU ). Yukarıdaki şekilde gösterildiği gibi yeşil renkli biliverdin’in, sarı renkli bilirubin’e redüktaz enzimi ile dönüşü sonucunda CO ortaya çıkar. Totalde 250 – 350 mg / gün bilirubin yapımı olur ( 1 g Hb yıkılırsa yaklaşık 35 mg Bilirubin ortaya çıkar ).
Karaciğerin parankim Smooth ER’da ( düz endoplazmik retikulumda ), insoluble ( indirekt = unkonjuge ) bilirubin’in konjugasyonu sonucu, suda çözünebilen, soluble direkt ( konjuge ) bilirubin oluşur. Glukuronatlar, HEME yapısının propiyonik asit kısımlarına bağlanır.Bunun için UDP glukuronat kullanılır. Böylece direkt bilirubin safraya salgılanabilir. Aşağıdaki şekilde de gösterildiği gibi Kanda İndirekt ( Nonkojuge, suda erimeyen ) Bilirubin, derhal ALBUMİN’e bağlanır ve Karaciğer parankim hücrelerine taşınır, Kandaki 1 gr Albumin yaklaşık 15 mg Bilirubin bağlayabilir ( NİSAN 1988, 1992 ve EYLÜL 2009 BİYOKİMYA TUS SORULARI ).
Şekil 2 : Kan, dalak ve karaciğerde bilirubin metabolizması.
Aşağıdaki şekilde görüldüğü gibi solubuliteyi sağlayan glukuronid yapısı glukoz ve UTP menşeylidir. Oluşan UDP Glukoz, 2 mol NAD+ ile birleşerek UDP GLUKURONİK ASİT yani UDP GLUKURONİD oluşturur. Bundan sonra yani Bilirubin’in detoKsifikasyon sürecinde, Hepatositlerde : GT enzimi ile İndirekt bilirubin , direkt yani konjuge bilirubin ( Suda erir, konjugasyon ) haline gelir ( EYLÜL 1994, 2004 BİYOKİMYA TUS SORULARI ).
Bu çok kısa olarak verilen bilirubin metabolizmasından da anlaşılacağı gibi, bilirubin idrara geçmez yani idrarda normalde bilirübin bulunmaz. Bilirübinin patolojik olarak idrara çıkışına bilirübinüri denir. Bilirübinüri görülebilmesi için, direkt bilirübinin kanda artması yani bir safra yolları tıkanıklığı gerekir. Sadece direkt ( konjuge, soluble, bağlı ) bilirübin idrara geçebilir. Serbest yani indirektbilirübin ise suda çözünmez, bu nedenle indirekt bilirubin, kan düzeyleri ne kadar artarsa artsın idrara çıkamaz, buna karşın kan-beyin bariyerini kolayca aşabilen bilirübin kısmıdır. Bağlı yani konjuge bilirübin ise glukuronik asitle bağlanan, suda çözünen ve kanda düzeyi arttığı hallerde ( safra yolları tıkanıklığı, taş, tümör vs. ) idrara çıkar.
Şekil 3 : Kan, karaciğer, safra kesesi ve barsaklardaki bilirubin metabolizması.
Bilirübin düzeylerinin kanda artması ( hiperbilirübinemi ), sarı renkli pigment olmasından dolayı özellikle mukozalarda ve gözlerde sklera tabakasında sarı pigment artışı görülür. Bu tabloya sarılık (ikter) adı verilir. İkterler, bilirübin metabolizmasındaki bozukluğun ortaya çıktığı aşamaya göre eritrositlerin aşırı yıkımı ile oluşan indirekt bilirubinemi’nin ortaya çıkardığı ve sadece deri, mukoza ve sklerayı sarartan tablo olan hemolitik ikter, karaciğer hücre hasarı nedeniyle bilirubinin glukouronik asitle bağlanamaması sonucu yani bozuk konjugasyon nedeni ile veya safraya atılamaması sonucu ( bozuk ekskresyon ) oluşan tablo hepatik ikter ve safra yollarını tıkayan tümör, taş gibi nedenlerin oluşturduğu obstrüktif ikter olmak üzere üçe ayrılır. Hepatik ikterde hem indirekt, hem de direkt bilirübin artışı olur. İdrarda da direkt bilirübin bulunur.
Obstrüktif ikterlerde ise safra yollarını tıkayan safra taşı, pankreas veya safra kanalı tümörleri gibi nedenler ilk sırayı alır. Bu durumda bilirübinin çoğu karaciğerde direkt bilirübin haline geçer fakat safra yolu obstrüksiyonu nedeni ile safra yoluyla barsağa atılamaz. Bu hastaların kanında artan direkt ( konjuge ) bilirübin oradan da idrara geçer ve idrar bilinen çay rengini alır. Bu durumun dışkı rengine de etkisi olur. Safra yolu obstrüksiyonu nedeniyle barsağa geçemeyen direkt bilirubin, barsakta oluşan ve dışkıya rengini veren sterkobilinojen (ve sterkobilin) oluşturamaz ve bu durumda dışkı renksiz olur.
Normalde kanda total bilirübin düzeyi 0.2-1.2 mg/dl’e kadar normaldir.Direkt bilirübin düzeyi ise kanda 0.2 mg/dL’yi geçmez. Direkt bilirübinin idrarda çıkması için kanda böbrek eşik değerinin üzerine çıkması gerekir. Bu eşik değeri direkt bilirubin için serumda ( kanda ) 1.2-1.4 mg/dl’dir. Direkt bilirubin düzeyini serumda ölçümde 1.4 mg/dl üzerinde ölçtüğümüzde bu durum direkt bilirubinin idrarda da görülmesini haber vermektedir. Ya da tersinden idrarda direkt bilirubin pozitif bulunduğunda, serum direkt bilirubin değeri en az 1.2 mg/dl’dir. Kanda bilirübin düzeyi 2.0 -2.5 mg/dl’yi geçtiğinde tüm dokulara yayılır ve ikter gözle görülür.
Şekil 4 : Bilirubin molekülünde hidrojen bağlarını koparan moleküller.
Bilirubinin suda çözünen formları esterifiye bilirubinlerdir ( glukuronidli bilirubinler ). İlk olarak 1883 yılında EHRLICH, kendi bulduğu diazotized sulfanilic asit reaktifi ( Ehrlich Ayıracı ) ile idrarda bilirubinleri ( glukuronidli ) reaksiyona girdirmiş ve oluşan azo – kırmızı- menekşe renkli pigmentler ile idrarda bilirubin varlığını kalitatif olarak göstermiştir. Oluşan renk asidik pH’da kırmızı iken, alkali pH’larda mavi renk alır. Bu reaktif de diazo reaktifi ( Ehrlich Reaktifi ) olarak bilinir.
Bilirubin ölçüm reaksiyonlarında sık kullanılan DİAZO ( Ehrlich ) reaktifini hazırlamak için : Sodyum NİTRİT suda çözülerek Diazo I reaktifi oluşturulur ve Sulfanilik asit de hidroklorik asitde çözülerek Diazo II reaktifi hazırlanır. solusyonlarından eşit hacimde taze olarak çalışma solüsyonu hazırlanmalıdır. Difillin ( Dyphylline ) ve sodyum askorbat da çalışma esnasında kullanılır. Çalışmada bilirubin standardı hazırlamak için bilirubin kloroformda çözülerek standart çalışması yapılabilir.
Daha sonraları 1916 yılında Hijmans-van den BERGH ve SNAPPER plazmada bilirubinleri kantitatif olarak tayin etmişlerdir. Van den BERGH, konjuge bilirubinin diazotized sulfanilic asit ile direkt olarak ( konjuge, direkt, glukuronidli bilirubin ) reaksiyon verdiğini, buna karşın ortamda reaksiyon vermeyen bilirubin formu kaldığını, bunun da ortama ancak methanol ilavesinden sonra indirekt olarak ( unkonjuge, indirekt bilirubin ) diazotized sulfanilic asit ile reaksiyon verdiğini gözlemledi.
Böylece bilirubin’in bu iki formunun ismi de bu çalışma ve gözlem sonucu böyle adlandırıldı ( direkt ve indirekt ).
Sonraki yıllarda 1922’de ADLER ve STRAUS, yukarıdaki şekildeki alkol ( metanol veya etanol ) yerine CAFFEINE-sodyum benzoat kullanarak reaksiyonu gerçekleştirdiler, ve onlar da indirekt bilirubini ölçtüler. Daha sonraları ise bu amaçla daha soluble olan DYPHYLLINE – sodyum asetat kullanılmıştır. Şu şekilde bir sınıflama yaparsak : Azo boyaları kullanarak bilirubin ölçüm yöntemleri aşağıda tabloda gösterilmiştir.
Şekil 5 : Azo boyaları ile bilirubin ölçüm metodlarına genel bir bakış.
Serumda total bilirubinden bahsediyorsak bu İndirekt bilirubin, bilirubin diglukuronid ve bilirubin monoglukuronid’den oluşmuş bir teşekkülden bahsediyoruz demektir.Serumda Bilirubin tayini için DİAZO reaksiyonu kullanılır. Bilinen iki yöntem Evelyn-Malloy ( Diazo reaktifi ( Sulfanilik asit + Sodyum Nitrit ), HCl asitlenmiş Metanol ) ve Jendrassik-Grof ( Kafein, sodyum benzoat, sodyum asetat, Diazo reaktifleri ) metodlarıdır.
Evelyn-Malloy’da metanol serbest bilirubini çözer, yani bilirubin içindeki hidrojen bağlarını parçalar. Ortamada metanol olmazsa o takdirde konjuge bilirubin ölçülür. Ortama diazolandırılmış sulfanilik asit eklenirse, total bilirubin azobilirubin kompleksi yapar ve kırmızı – mor renk oluşur.
Jendrassik-Grof metodunda ise numune, kafein+sodyum benzoat+sodyum asetat ortamında inkübe edilirken ortama yine diazolandırılmış sülfanilik asit ilave edildiğinde, yine kırmızı – mor renkli azobilirubin kompleksi oluşur. Sodyum asetat tampon olarak alkali pH sağlar. Kafein ve benzoat da bilirubin molekülü içindeki hidrojen bağlarını parçalar. Dimetil sülfoksit ve 2,4-dikloranilin de benzer şekilde bilirubin’in hidrojen bağlarını koparır. Bağları koparılmış bilirubin, diazolandırılmış sülfanilik asit çok kolay bir şekilde reaksiyona girer. Eğer ortama C vitamini yani askorbat ilave edilirse reaksiyon durur. Ortama alkali pH’daki Tartarat ilave edilirse, azobilirubin kompleksinin kırmızı-mor rengi, mavi renge dönüşür. Bilirubin ışığa duyarlıdır ve ölçümü etkilememesi için ışığa maruz bırakılmamalıdır.
Şekil 6 : Bilirubin ölçümünde Azobilirubin oluşumu.
Görüldüğü üzere bilirubin tayin yöntemleri Diazo reaksiyonu ( bilirübin ile diazolandırılmış sülfanilik asidin asit ortamda birleşerek kırmızı – mor renkli kompleksler, alkali ortamda azobilirubin’in tartarat ile mavi renkli kopleksler oluşturması ) prensibine dayanır.
Fakat bazı patolojik durumlarda bilirubinüri görülebilmektedir. İdrarda bilirubin arama metodlarından en bilineni Diazo testidir. Bir diğer test grubu oksidasyon testleridir.
Bilirubin’in oksidasyon testlerinde bilirubin, biliverdin’e okside olur ve bu ürün yeşil renkli olduğundan, idrarda bilirubin olduğu anlaşılır. Bu test GMELİN testi adıyla anılır. Bilirubin tayinine yaradığı gibi aynı reaksiyonu timol, formalin ve potasyum iyodür ile de verebilir. Aynı test derişik nitrik asit yerine alkol iyodo solüsyonu ile yapılırsa, yine yeşil renkli halka oluşur ve bu sefer bu testin adına da ROSİN – TROUSSEAU testi denir.
Şekil 7 : Bilirubin ölçümünde bilirubin’in biliverdin’e dönüşümü.
